黃芩苷抑制內皮損傷誘導的血管新生內膜形成及其機制.pdf

1、目的：血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖是血管再狹窄的主要病理基礎。黃芩苷（baicalin）是從中草藥黃芩中分離出來的一種黃酮類化合物。以往研究發(fā)現，黃芩苷對腫瘤細胞的增殖具有明顯的抑制作用。但其是否影響血管內皮損傷所誘導的血管內膜增生尚不清楚。本研究從以下幾方面探討黃芩苷對血管新生內膜形成的影響及其作用機制。
　　 方法：
　　 1 VSMC的培養(yǎng)：按貼塊法分離培養(yǎng)

2、VSMC，取3～6代細胞進行實驗。傳代培養(yǎng)的VSMC生長到80％～90％匯合時，給予不同濃度黃芩苷（5、10、20、40μmol/L）預處理。
　　 2 Western blot分析：取等量蛋白的提取液上樣，進行SDS-PAGE。電轉移至PVDF膜上。隨后與相應的一抗及二抗反應，用化學發(fā)光法檢測抗原抗體結合區(qū)帶。用數碼成像分析系統軟件對結果進行定量分析。
　　 3球囊損傷模型的復制及分組
　　 將SD大鼠（250

3、～300g）常規(guī)麻醉消毒，沿頸部正中線切口，暴露左側頸外動脈，在頸外動脈剪一楔形切口，將球囊導管自切口插入至胸腹主動脈遠心端，充盈球囊后反復回拉三次，退出，結扎頸外動脈，關閉切口。實驗動物分假手術組、球囊損傷組、黃芩苷組。
　　 4標本的處理
　　 于術后14天從股動脈放血處死大鼠，分離頸總動脈，制備病理切片。
　　 結果：
　　 1黃芩苷抑制PDGF誘導的VSMC增殖
　　 MTT分析結果表明，

4、黃芩苷能以濃度（5、10、20、40μmol/L）依賴的方式抑制VSMC增殖，具有明顯的量-效關系。
　　 2黃芩苷對VSMC增殖標志基因PCNA表達的影響
　　 免疫細胞化學和Western blot分析顯示，正常細胞中PCNA呈低水平表達，PDGF（10 ng/ml）刺激后PCNA水平大幅度升高，而藥物預孵育則使PCNA水平下降。提示黃芩苷具有抑制PDGF誘導的VSMC增殖的作用。
　　 3黃芩苷抑制PDGF

5、激活的PDGFR/MEK/ERK1/2信號通路
　　 Western blot結果顯示，PDGF刺激細胞15 min，PDGFR磷酸化水平明顯升高；而經黃芩苷預處理的VSMC，磷酸化的PDGFR呈濃度依賴性的降低；進而對其下游的MEK、ERK1/2活性進行分析，發(fā)現MEK和ERK1/2磷酸化程度也隨著藥物濃度的增加逐漸降低；但磷酸化的JNK、p38、Akt不受藥物處理的影響。提示黃芩苷是通過特異性抑制MEK/ERK1/2通路活化

6、來抑制PDGF誘導的VSMC的增殖。
　　 4黃芩苷抑制球囊損傷后血管內膜的增生
　　 球囊損傷術后14天，黃芩苷組血管內膜的增生程度較球囊損傷組明顯減輕，兩組的血管內膜/中膜（I/M）厚度比分別為0.43±0.04和2.36±0.15，具有顯著性差異（P<0.01）。表明黃芩苷可以明顯抑制球囊損傷誘導的血管內膜增生。
　　 5黃芩苷抑制新生內膜中PCNA表達
　　 形態(tài)學分析顯示：正常血管內膜中僅有少量

7、PCNA表達，球囊損傷14天后，血管中PCNA陽性的細胞數明顯增多；而黃芩苷可明顯抑制PCNA的表達，與模型組相比PCNA陽性的細胞數減少了53.4％，具有顯著性差異（P<0.01）。提示黃芩苷可抑制血管細胞的增殖活性。
　　 6黃芩苷抑制球囊損傷誘導的ICAM-1和VCAM-1的表達
　　 免疫組織化學染色顯示：正常血管內膜中可見極少量的ICAM-1和VCAM-1著色顆粒。球囊損傷14天后，兩種蛋白陽性染色的細胞數及單

8、細胞染色強度均較正常組顯著增加。而黃芩苷能夠顯著抑制球囊損傷誘導的ICAM-1和VCAM-1的表達，與模型組相比陽性染色的細胞數分別降低了55.8±6.9％和57.2±5.5％，具有顯著性差異（P<0.01，P<0.01）。
　　 結論：
　　 1黃芩苷抑制PDGF誘導的VSMC增殖。
　　 2黃芩苷抑制VSMC增殖的機制與阻斷PDGFR/MEK/ERK1/2信號通路有關。
　　 3黃芩苷可預防內皮損傷所