SM22α和黃芩苷抑制血管平滑肌細胞增殖和新生內(nèi)膜形成的分子機制.pdf

1、血管平滑肌細胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）增殖與遷移在高血壓、動脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管增殖性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　 血小板源性生長因子（platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）是一種強效促有絲分裂劑，是介導(dǎo)VSMC增殖和內(nèi)膜增生的重要因素之一。PDGF通過VSMC膜上的特異性受體將生長信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)并激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-ac

2、tivatedproteinkinase，MAPK）信號通路，包括Ras、Raf、MEK1/2和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellularsignal-regulatedkinase.ERK）1/2的順序激活，進而促進細胞的增殖與遷移。
　　 平滑肌22alpha（smoothmuscle22alpha，SM22α）是一種actin骨架調(diào)節(jié)蛋白，特異表達于收縮型VSMC中。以往研究顯示，SM22α具有抑制VSMC從收縮型向合

3、成型轉(zhuǎn)化，以及抑制動脈粥樣斑塊形成的作用。然而，有關(guān)SM22α是通過什么機制發(fā)揮作用，如何維護VSMC收縮表型穩(wěn)定性的尚無研究報道。本研究采用過表達或敲低技術(shù)，系統(tǒng)觀察了SM22α在體內(nèi)、外抑制VSMC增殖和血管內(nèi)膜增生的生物活性，并對其作用機制進行研究。在此基礎(chǔ)上，比較觀察了黃芩苷抑制VSMC的活性和獨有的分子機制。
　　 1.SM22α通過阻斷Ras-ERK1/2信號通路而抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖1.1SM22α

4、過表達抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC生長首先，構(gòu)建含有SM22α全長cDNA的腺病毒質(zhì)粒Ad-SM22α，用其感染VSMC，Westernblot結(jié)果顯示，SM22α的表達明顯增加，并且細胞增殖標志基因PCNA的表達量隨著SM22α表達量的增加而減少。細胞計數(shù)和MTT分析結(jié)果顯示，SM22α過表達抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖，其抑制作用具有劑量依賴性。
　　 1.2SM22α過表達抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC細胞周

5、期進程SM22α抑制VSMC生長可能是由于抑制增殖和/或誘導(dǎo)凋亡，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，PDGF-BB刺激VSMC24h后，感染Ad-SM22α的VSMC中處于G0/G1期的細胞顯著增多；但是，感染Ad-SM22α的VSMC其細胞凋亡和caspases活性與撤血清組和Ad-null感染組相比沒有變化。說明SM22α過表達抑制VSMC生長主要是誘導(dǎo)細胞周期停滯在G0/G1期的結(jié)果。進一步分析顯示，過表達SM22α可降低cyclinD1水

6、平，上調(diào)p21和p27的表達。以上結(jié)果表明，SM22α過表達抑制VSMC的細胞周期進程。
　　 1.3SM22α通過與Ras相互作用而阻斷Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號級聯(lián)為了確定SM22α是否影響生長信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，觀察SM22α對MAPK信號通路的調(diào)節(jié)作用。發(fā)現(xiàn)過表達SM22α顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的ERK1/2的激活，而對JNK和p38沒有影響，而且，過表達SM22α顯著抑制ERK1/2的上游激酶MEK1/2和

7、Raf-1的活性。并且，過表達缺失actin結(jié)合結(jié)構(gòu)域的突變體SM22α（1-151）亦可顯著抑制ERK1/2信號級聯(lián)的活性和細胞增殖。表明SM22α抑制增殖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用不依賴于其actin結(jié)合域。用持續(xù)激活ERK的pCMV-MEK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達SM22α的VSMC，結(jié)果顯示，ERK的激活可以抵消SM22α的抗增殖作用。以上結(jié)果表明，SM22α誘導(dǎo)細胞周期阻滯是通過抑制Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號通路實現(xiàn)的。
　

8、　 Ras是Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號通路上游的一個重要的信號蛋白，在G1期發(fā)展和G1-S期轉(zhuǎn)換過程中具有重要作用。過表達SM22α可輕度上調(diào)Ras的表達。交互免疫共沉淀分析和GSTpull-down分析結(jié)果均顯示，SM22α與Ras直接相互作用，而且，二者相互作用的程度依賴于SM22α的水平。激光共聚焦檢測結(jié)果亦顯示，SM22α與Ras共定位于膜周區(qū)域，并且感染Ad-SM22α的VSMC中二者的共定位增加。用TGF-

9、β1或ATRA誘導(dǎo)內(nèi)源性SM22α高表達后，SM22α與Ras的相互作用亦增加，進一步說明SM22α與Ras相互作用呈SM22α劑量依賴性，而與細胞的表型無關(guān)。以上結(jié)果表明，SM22α通過與Ras相互作用而抑制Ras募集和激活Raf-1，進而抑制Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號通路的活化。
　　 1.4敲低SM22α通過激活Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號通路而促進VSMC增殖利用小干擾RNAsiSM22α敲

10、低VSMC內(nèi)源性SM22α的表達后，Ras的表達也輕微降低。并且，ATRA刺激誘導(dǎo)的G0/G1期阻滯被消除，進入S期的細胞增多，敲低SM22α還可以抵消ATRA對Raf-1-MEK-1/2-ERK1/2信號通路的抑制作用。該結(jié)果佐證了SM22α具有抗增殖活性的觀點。
　　 總之，收縮型VSMC標志物SM22α是一種內(nèi)源性Ras抑制因子，通過阻斷Ras-ERK1/2信號級聯(lián)的誘導(dǎo)，進而阻滯細胞周期進程，抑制VSMC增殖，維持VSM

11、C收縮表型的穩(wěn)定性。
　　 2.過表達SM22α抑制VSMC遷移和球囊損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜增生2.1過表達SM22α抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生利用大鼠主動脈球囊損傷模型，觀察感染Ad-SM22α后，對新生內(nèi)膜形成的影響。HE染色結(jié)果顯示，損傷14天或28天后，與未感染組或Ad-null組相比，Ad-SM22α組的血管內(nèi)膜/中膜（I/M）比值明顯降低。免疫組織化學結(jié)果顯示，Ad-SM22α組的血管新生內(nèi)膜中SM22α陽性的細胞數(shù)

12、明顯增多，p27的蛋白水平升高，PCNA的表達減少。結(jié)果表明，SM22α過表達可抑制新生內(nèi)膜的形成。
　　 2.2過表達SM22α抑制球囊損傷激活的Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號通路為了證明體內(nèi)SM22α過表達抑制新生內(nèi)膜增生是否與ERK1/2MAPK信號通路有關(guān)，本研究檢測了球囊損傷3天時，SM22α對ERKMAPK信號通路的影響。Westernblot結(jié)果顯示，過表達SM22α的血管新生內(nèi)膜中損傷誘導(dǎo)的Raf-1

13、-MEK-1/2-ERK1/2通路的活化被抑制。SM22α對膜通路的抑制效應(yīng)與其抗內(nèi)膜增生作用具有一致關(guān)系，同時也進一步表明，SM22α的抗增殖性質(zhì)可用于指導(dǎo)設(shè)計防治血管再狹窄新型藥物。
　　 2.3過表達SM22α抑制VSMC遷移VSMC遷移與細胞增殖是損傷誘導(dǎo)血管內(nèi)膜增厚的先決條件。本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達SM22α抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC遷移，其抑制遷移的機制可能與下調(diào)VSMC中MMP-9的表達有關(guān)，動物實驗也顯示，球

14、囊損傷3天或28天后，Ad-SM22α感染組的血管壁中MMP-9的表達也明顯減少。以上結(jié)果說明，過表達SM22α抑制VSMC遷移。
　　 3黃芩苷通過阻斷ERK通路和eyelinE-CDK2激活，從而抑制VSMC增殖和血管新生內(nèi)膜形成3.1黃芩苷抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移以往研究證實，黃芩苷具有抗腫瘤活性，抑制腫瘤細胞的細胞周期進程。本研究首先利用MTT分析檢測黃芩苷對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響，結(jié)果

15、顯示，黃芩苷可劑量依賴地抑制VSMC增殖，高劑量（40μM和60μM）的黃芩苷幾乎完全阻斷了細胞的增殖活性。而黃芩苷對靜止期的VSMC活力無明顯影響。說明本研究所用濃度的黃芩苷沒有細胞毒性。流式細胞分析結(jié)果顯示，黃芩苷預(yù)處理后，G0/G1期細胞顯著增加，而S期與G2/M期細胞顯著減少。Westernblot結(jié)果顯示，黃芩苷抑制PCNA的表達，誘導(dǎo)p27的表達。上述結(jié)果表明，黃芩苷誘導(dǎo)細胞周期阻滯，進而抑制VSMC增殖。
　　 P

16、DGF不僅是強效絲裂原，而且還是一種趨化因子，在介導(dǎo)VSMC向內(nèi)膜下遷移過程中發(fā)揮重要作用。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，黃芩苷抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC遷移，與PDGF-BB刺激組相比，黃芩苷預(yù)處理組遷移細胞數(shù)減少了60％；黃芩苷可降低PDGF-BB誘導(dǎo)的遷移相關(guān)蛋白OPN、ICAM-1、VCAM-1和MMP-2的上調(diào)。但是，流式細胞術(shù)和caspase-3活性分析均說明，黃芩苷對細胞凋亡無明顯影響。
　　 3.2黃芩苷抑制VSM

17、C中cyclinE-CDK2復(fù)合物的形成和p27的磷酸化
　　 3.3黃芩苷抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的PDGFRβ-ERK信號通路激活
　　 3.4黃芩苷抑制球囊損傷介導(dǎo)的新生內(nèi)膜增生
　　 綜上所述，黃芩苷通過阻斷PDGFRβ-ERK1/2信號級聯(lián)的活化，抑制cyclinE-CDK2的激活以及上調(diào)p27蛋白水平進而抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖，并且可預(yù)防損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生。
　　 結(jié)論

18、　　 1.SM22α過表達可以競爭性抑制Ras與Raf-1的結(jié)合，阻斷Raf-1-MEK1/2-ERK1/2信號通路，進而阻滯PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC的細胞周期進程，抑制VSMC增殖和遷移。
　　 2.過表達SM22α通過阻斷Ras-ERK1/2信號通路，抑制球囊損傷引起的血管新生內(nèi)膜增生。
　　 3.黃芩苷通過阻斷PDGFR介導(dǎo)的MEK1/2-ERK1/2信號通路活化，抑制cvclinE-CDK2激活和上調(diào)p27