人胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為類(lèi)肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:1.建立人胎兒骨髓、臍帶血和肝臟間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分離培養(yǎng)方法,觀(guān)察細(xì)胞生物學(xué)特性和細(xì)胞表型,獲得大量的人源性MSCs.2.人胎兒MMSCs體外向類(lèi)肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的條件建立及優(yōu)化.3.人胎兒MMSCs來(lái)源類(lèi)肝細(xì)胞的分子生物學(xué)鑒定.4.人胎兒MMSCs來(lái)源類(lèi)肝細(xì)胞的功能和超微結(jié)構(gòu)評(píng)估.結(jié)論:人胎兒MMSCs分離成分單純,容易成功,增生旺盛,作為組織工程重建的種子細(xì)胞具有較強(qiáng)的可行

2、性.從臍帶血中成功分離MSCs的幾率為20﹪,但臍帶血來(lái)源廣泛,無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議,所獲得的MSCs也具有良好的增殖能力,也可作為MSCs的來(lái)源.肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中也含有MSCs,且量比較大,也可成為種子細(xì)胞.我們建立了多條獲取人源性MSCs的途徑,為MSCs的分化及大規(guī)模臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).通過(guò)比較三種來(lái)源MSCs各自的優(yōu)點(diǎn)和不足,我們選擇人胎兒骨髓來(lái)源的MSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化.細(xì)胞分化受細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞因子、細(xì)胞密度等影響,在無(wú)血清培養(yǎng)條件下,

3、設(shè)計(jì)了多組誘導(dǎo)方案,證實(shí)按誘導(dǎo)4組的方案1﹪Matrigel作基質(zhì),2.5μmol/ml AZA預(yù)處理10~12h,HGF 10ng/ml+FGF4 10ng/ml+HGM培養(yǎng)基可獲得61﹪~65﹪的類(lèi)肝細(xì)胞.MMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后于第4d時(shí)表達(dá)GATA4、CK19、AFP;第7d后以時(shí)間依賴(lài)方式表達(dá)原始、成熟肝細(xì)胞標(biāo)志CK18、ALB、GST-π和HNF1α.MMSCs向類(lèi)肝細(xì)胞的橫向分化是先分化為肝前體細(xì)胞,再分化為成熟肝細(xì)胞,在該實(shí)驗(yàn)