肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、目的：探討肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells MSCs)的體外擴(kuò)增培養(yǎng)生長特性及其誘導(dǎo)分化為肝功能細(xì)胞的能力，為肝組織工程“種子細(xì)胞”的選擇提供新的理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肝衰竭時移植細(xì)胞在體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。 方法：無菌抽取我科4例肝硬化志愿者骨髓3～4ml，年齡30～40歲，利用密度梯度離心法(1.073g/L ficoll)聯(lián)合貼壁

2、篩選法逐步篩選MSCs，獲取MSCs，倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞生長特性，以cell Counter做細(xì)胞計數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD44、CD45。制作細(xì)胞爬片，取第三代培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞分成兩組：A組HGF(20mg/ml)+IL-6(10ng/ml)+基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)。B組(空白對照組)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(胎牛血清+L-DMEM)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化過程中細(xì)胞形態(tài)變化，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)后0、7、14、21、

3、28d時取出爬片免疫細(xì)胞化學(xué)染色測定肝細(xì)胞特征表型甲胎蛋白(AFP)、細(xì)胞角蛋白18(CK18)的表達(dá)情況并于誘導(dǎo)培養(yǎng)后多時間點測定培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的AFP和CK18的陽性表達(dá)率(﹪)，并與空白對照作作以比較，得出結(jié)論。 結(jié)果：原代培養(yǎng)細(xì)胞生長潛伏期0～9d,對數(shù)增殖期為10～19d，生長平臺期為20～24d；傳代細(xì)胞生長周期較原代細(xì)胞快，細(xì)胞生長潛伏期為4～24h，對數(shù)增殖期為3～12d，13～15d進(jìn)入生長平臺期。肝硬化患者骨髓