人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及向肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的實驗研究.pdf

1、目的：分離、培養(yǎng)、凍存人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)，并檢測人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能否在體外誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞。 方法：利用Ficoll密度梯度離心法與貼壁法相結(jié)合，分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增人MSCs，將第3-5代人MSCs用流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞表面標(biāo)志；在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)下向成骨細(xì)胞分化，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并檢測堿性磷酸酶(AKP)染色；并在肝細(xì)胞生長因子(HGF)及成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-4)的誘導(dǎo)下定向分化為肝樣細(xì)胞，觀察

2、其形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)行PAS染色檢測糖原，并通過RT—PCR、免疫熒光反應(yīng)檢測肝樣細(xì)胞的特異標(biāo)志物ALB、CK18、AFP，鑒定誘導(dǎo)細(xì)胞的性質(zhì)。 結(jié)果：體外分離、培養(yǎng)出的hMSCs呈成纖維樣細(xì)胞，形態(tài)均一，生長狀態(tài)良好，第3-5代人骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測高表達(dá)表面CD29 CD105，不表達(dá)CD34。經(jīng)凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞形態(tài)無明顯差別，均呈典型的梭形；hMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)3周后，行堿性磷酸酶染色陽性。加入HGF、FGF

3、4等細(xì)胞因子進(jìn)行肝細(xì)胞誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)由紡錘形漸轉(zhuǎn)為小圓形，與肝細(xì)胞相似；培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞用免疫熒光法及RT—PCR法檢測陽性，并糖原染色呈現(xiàn)陽性。 結(jié)論：培養(yǎng)擴(kuò)增的人MSCs具有均一的形態(tài)，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，細(xì)胞純度較高；經(jīng)短期凍存復(fù)蘇后，仍具較高的活性和增殖能力；在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下，能向成骨細(xì)胞分化；在HGF及FGF-4的作用下，可成功向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化，分化的細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞表面標(biāo)志物ALB、AFP、CK18，并PAs染色