人骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及向肝樣細胞誘導分化的實驗研究.pdf

1、目的：分離、培養(yǎng)、凍存人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)，并檢測人骨髓間充質(zhì)干細胞能否在體外誘導分化為肝樣細胞。 方法：利用Ficoll密度梯度離心法與貼壁法相結(jié)合，分離、培養(yǎng)、擴增人MSCs，將第3-5代人MSCs用流式細胞儀檢測其細胞表面標志；在成骨細胞誘導劑的誘導下向成骨細胞分化，觀察細胞形態(tài)學變化，并檢測堿性磷酸酶(AKP)染色；并在肝細胞生長因子(HGF)及成纖維細胞生長因子(FGF-4)的誘導下定向分化為肝樣細胞，觀察

2、其形態(tài)學變化，進行PAS染色檢測糖原，并通過RT—PCR、免疫熒光反應(yīng)檢測肝樣細胞的特異標志物ALB、CK18、AFP，鑒定誘導細胞的性質(zhì)。 結(jié)果：體外分離、培養(yǎng)出的hMSCs呈成纖維樣細胞，形態(tài)均一，生長狀態(tài)良好，第3-5代人骨髓問充質(zhì)干細胞用流式細胞儀檢測高表達表面CD29 CD105，不表達CD34。經(jīng)凍存復蘇后，細胞形態(tài)無明顯差別，均呈典型的梭形；hMSCs經(jīng)成骨誘導液誘導3周后，行堿性磷酸酶染色陽性。加入HGF、FGF

3、4等細胞因子進行肝細胞誘導后，細胞形態(tài)由紡錘形漸轉(zhuǎn)為小圓形，與肝細胞相似；培養(yǎng)誘導的細胞用免疫熒光法及RT—PCR法檢測陽性，并糖原染色呈現(xiàn)陽性。 結(jié)論：培養(yǎng)擴增的人MSCs具有均一的形態(tài)，經(jīng)流式細胞儀檢測，細胞純度較高；經(jīng)短期凍存復蘇后，仍具較高的活性和增殖能力；在成骨細胞誘導液的誘導下，能向成骨細胞分化；在HGF及FGF-4的作用下，可成功向肝細胞誘導分化，分化的細胞表達肝細胞表面標志物ALB、AFP、CK18，并PAs染色