抗原負(fù)載的DC與CIK共培養(yǎng)后對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞株殺傷活性的研究.pdf

1、目的：胃癌是對(duì)人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤之一，目前胃癌臨床治療手段主要是根治性切除手術(shù)輔以術(shù)前、術(shù)后化療及放射治療。由于臨床所見病例多為中晚期患者，手術(shù)及放、化療效果差，長(zhǎng)期生存率較低，因此，如何提高胃癌根治術(shù)后效果，改善胃癌晚期患者生活質(zhì)量，預(yù)防胃癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移一直是臨床長(zhǎng)期探索的問題。 腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療(adoptive cellular immunotherapy,ACI)是繼手術(shù)、化療和放療之后的第四種腫瘤治療

2、模式。迄今，NK細(xì)胞、CTL、Mφ、TIL、LAK、CIK和DC細(xì)胞的過繼治療已在臨床上得到應(yīng)用，其中CIK和DC細(xì)胞為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫治療以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，近年來成為國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells,CIK)是由多種細(xì)胞因子如IL-2、IFN-γ和CD3單克隆抗體等誘導(dǎo)而成的對(duì)多種腫瘤具有殺傷活性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其溶瘤活性具有非MHC限制性，是一種非

3、特異性的免疫殺傷細(xì)胞。CIK細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子(如IL-4、IFN-γ等)，且具有比LAK、CD3AK細(xì)胞更強(qiáng)的殺傷活性。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是功能強(qiáng)大的主要的抗原遞呈細(xì)胞，分布于除腦和睪丸以外身體各部的任何組織，DC借助膜表面不同受體可有效捕獲低濃度抗原，并能與這些抗原表面的MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子結(jié)合，刺激初始型CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞活化。綜合國內(nèi)外研究表明，將負(fù)載腫瘤抗原的DC細(xì)胞和具有高效

4、殺傷活性的CIK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用治療惡性腫瘤，將有望起到協(xié)同作用。本研究將利用MTT法和流式細(xì)胞儀分別完成負(fù)載抗原的DC和CIK的聯(lián)合培養(yǎng)物對(duì)MGC-803的殺傷活性和凋亡機(jī)制的初步研究，為DC和CIK聯(lián)合治療胃癌應(yīng)用于臨床打下科研基礎(chǔ)。 材料與方法： 1、PBMC來源的CIK和DC細(xì)胞制備：提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，在體外以基因重組人白介素-2 (interleukine-2,IL-2)、鼠抗人CD3單抗(ant

5、i-CD3McAb)、基因重組人白介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、基因重組人干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)等細(xì)胞因子刺激非貼壁細(xì)胞獲得成熟CIK；以基因重組人粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage CSF,GM-CSF)和基因重組人白介素-4(interleukine-4,IL-4)刺激貼壁細(xì)胞獲得DC，并以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型。 2、MGC-80

6、3胃癌細(xì)胞可溶性抗原制備及定量：以液氮反復(fù)凍融MGC-803細(xì)胞，過濾，制成用以刺激DC細(xì)胞的可溶性抗原，以考馬斯亮藍(lán)法對(duì)蛋白抗原進(jìn)行定量測(cè)定。 3、不同效靶比和培養(yǎng)天數(shù)下，不同效應(yīng)細(xì)胞組殺傷功能的比較：將效應(yīng)細(xì)胞分作3組：?jiǎn)渭僀IK組、未負(fù)載MGC-803抗原的DC+CIK組和負(fù)載MGC-803抗原的DC+CIK組，分別記做：CIK、DC-CIK和Ag-DC-CIK。效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)12d后，以MTT法測(cè)定CIK、DC-CIK和A

7、g-DC-CIK對(duì)MGC-803殺傷作用，效靶比分別為：2.5:1、5:1、10:1、20:1，并測(cè)定不同時(shí)間對(duì)其作用的影響。 4、酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)外分泌細(xì)胞因子水平：提取培養(yǎng)6d、12d和21d的Ag-DC-CIK細(xì)胞上清液，檢測(cè)細(xì)胞外分泌細(xì)胞因子IL-2、TNF-α、INF-γ含量隨培養(yǎng)天數(shù)的變化。 5、Ag-DC-CIK對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖及凋亡的作用：將培養(yǎng)18d的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞混合培養(yǎng)(E:T=20:1

8、)24h后，收集細(xì)胞，加入Hoechst 33342至終濃度為1ug/ml，37℃孵育10min，離心，棄染液。加入PI染液重懸避光染色。流式細(xì)胞儀分析藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。 結(jié)果： 1、單獨(dú)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞在第3d開始增殖，第5-6d進(jìn)入快速增殖期，CIK細(xì)胞和DC(包括負(fù)載和未負(fù)載MGC-803抗原)共培養(yǎng)后的第12d開始，共

9、培養(yǎng)細(xì)胞組的增殖速度開始明顯增快，并快于同源CIK細(xì)胞(p<0.05)。 2、健康成年P(guān)BMC在體外可以分別由IL-2、CD3McAb、IL-1α、INF-γ和GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)出經(jīng)表型鑒定為成熟的CIK和DC細(xì)胞。其中有(79.64±3.41)％的細(xì)胞表達(dá)成熟DC特異性表面標(biāo)志CD83，(95.17±1.22)％的細(xì)胞表達(dá)HLA-DR，(94.66±2.42)％的細(xì)胞表達(dá)CD86，(86.59±1.09)％的細(xì)胞表達(dá)C

10、D40。與DC共培養(yǎng)的CIK細(xì)胞在培養(yǎng)第14d時(shí)CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細(xì)胞的百分含量進(jìn)一步升高到59.39％-60.46％和35.67％-36.90％，經(jīng)抗原刺激過的DC與CIK共培養(yǎng)14d后，混合細(xì)胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+細(xì)胞最多，達(dá)到63.63％-65.42％和51.03％-53.15％，與CIK組和DC-CIK組相比均具有顯著性差異(p＜0.05)。 3、在2.5:1-20:1效靶比范圍

11、內(nèi)，DC-CIK對(duì)MGC-803靶細(xì)胞的殺傷活性一般均高于同源CIK細(xì)胞，經(jīng)MGC-803細(xì)胞凍融物致敏的Ag-DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)MGC-803靶細(xì)胞的殺傷活性有進(jìn)一步的提高，與單純CIK細(xì)胞組比較差異顯著(p＜0.05)，與DC-CIK共培養(yǎng)細(xì)胞組比較也有顯著性差異(p＜0.05)。 4、IFN-γ在21d的混合細(xì)胞上清液中表達(dá)較高，TNF-α在各個(gè)時(shí)期均能檢測(cè)到，但表達(dá)水平變化很明顯，在第6d時(shí)低表達(dá)，21d時(shí)較高。促

12、炎因子IL-2變化正好與TNF-α相反，主要在第6d高表達(dá)，21d時(shí)表達(dá)相對(duì)較低或不表達(dá)。 5、24h組凋亡早期、中期、晚期細(xì)胞及正常細(xì)胞在FCM散點(diǎn)圖中占絕大多數(shù)比例，而48h組以壞死細(xì)胞為主，凋亡細(xì)胞已較24h明顯減少。 結(jié)論： 1、負(fù)載MGC-803胃癌細(xì)胞抗原的DC可使CIK的增殖速度進(jìn)一步提高。 2、負(fù)載MGC-803抗原的DC與CIK共培養(yǎng)后可使具備攻擊能力的主要細(xì)胞群CD3+CD8+、CD3

13、+CD56+雙陽性細(xì)胞群比例分別進(jìn)一步提高。 3、經(jīng)抗原沖擊的DC與CIK共培養(yǎng)后能增強(qiáng)其對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的殺傷活性。 4、Ag-DC-CIK在體外培養(yǎng)過程中不僅需要持續(xù)來源于外界細(xì)胞因子的存在，而且該效應(yīng)細(xì)胞組還能夠向細(xì)胞外分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2影響其自身的功能。 5、在效靶相互作用初期，Ag-DC-CIK對(duì)MGC-803的殺傷作用主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)發(fā)生自身凋亡來實(shí)現(xiàn)；在相互作