法樂(lè)四聯(lián)癥相關(guān)基因的研究.pdf

1、第一部分：法樂(lè)四聯(lián)癥相關(guān)基因的篩選與鑒定 目的：通過(guò)比較法樂(lè)四聯(lián)癥患兒心肌與發(fā)育正常心肌組織間的全基因組表達(dá)譜差異，進(jìn)一步揭示法樂(lè)四聯(lián)癥發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在分子機(jī)制。 方法：采用含21 329條Oligo DNA的人類(lèi)全基因組寡核苷酸表達(dá)譜芯片，對(duì)5例法樂(lè)四聯(lián)癥息兒心肌組織與5例發(fā)育正常的心肌組織配對(duì)檢測(cè)差異表達(dá)基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析，我們將上述差異表達(dá)基因進(jìn)行分類(lèi)并挑選出了與法樂(lè)四聯(lián)癥發(fā)生相關(guān)的差異表達(dá)基因，并采用實(shí)時(shí)定

2、量PCR及免疫組化技術(shù)在更多樣本中驗(yàn)證芯片的結(jié)果。鑒于與本組法樂(lè)四聯(lián)癥患兒年齡相匹配的正常心肌組織難以獲取，在基因芯片的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們采用了發(fā)育正常引產(chǎn)胎兒心肌組織作為對(duì)照，為彌補(bǔ)芯片實(shí)驗(yàn)中由于年齡不匹配及手術(shù)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，在接下來(lái)的實(shí)時(shí)定量PCR及免疫組化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中我們采用了法樂(lè)四聯(lián)癥患兒心肌、發(fā)育正常胎兒心肌、與TOF患兒年齡匹配的單純室間隔缺損患兒心肌及發(fā)育正常的成人心肌組織各10例來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果。 結(jié)果：共

3、有242個(gè)基因在全部5張基因芯片中存在共同的差異表達(dá)，依據(jù)上述基因所參與的主要的生物學(xué)過(guò)程，我們將上述242個(gè)基因分為13類(lèi)，在“發(fā)育相關(guān)基因”中我們發(fā)現(xiàn)圓錐動(dòng)脈干畸形候選基因CSPG2與NTRK3的表達(dá)在TOF組患兒中存在明顯的表達(dá)減低，在接下來(lái)的擴(kuò)大樣本量的實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)NTRK3基因的表達(dá)在mRNA水平和蛋白水平TOF組患兒中均特異性表達(dá)減低，而CSPG2基因的表達(dá)則隨年齡的增加而增加。 結(jié)論：

4、我們的研究結(jié)果提示，NTRK3基因的表達(dá)減低可能與人類(lèi)法樂(lè)四聯(lián)癥右心室流出道畸形的發(fā)生，發(fā)展相關(guān)。 第二部分法樂(lè)四聯(lián)癥候選致病基因HEY2突變的初步分析 目的：探討中國(guó)法樂(lè)四聯(lián)癥患兒HEY2基因突變的情況。 方法：法樂(lè)四聯(lián)癥患者52例，其中男性30例，女性22例，年齡5.74±2.50(3個(gè)月～9歲)，均為我院小兒外科中心住院患兒，其中心臟畸形為單發(fā)法樂(lè)四聯(lián)癥患者38例，伴發(fā)其他心臟畸形14例，其中5例合并動(dòng)脈導(dǎo)

5、管未閉+房間隔缺損，2例合并動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，2例合并卵圓孔未閉，1例合并房間隔缺損，合并單發(fā)右位心，單冠畸形、左肺動(dòng)脈缺如、永存左上腔靜脈患者各1例。經(jīng)心臟超聲檢查和(或)心導(dǎo)管、心外科手術(shù)明確診斷。所有研究對(duì)象無(wú)血緣關(guān)系，均行全面完整的體格檢查，合并其他心外畸形患兒在本研究中予以排除，以除外綜合征型TOF患兒。50例健康人作為正常研究對(duì)照。征得患兒家長(zhǎng)同意后，抽取患兒外周血3mL，以EDTA抗凝，-70℃保存，常規(guī)胍鹽酸法抽提基因組DN

6、A，應(yīng)用遞減聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)上述患兒及對(duì)照者的HEY2基因全部外顯子及其側(cè)翼序列進(jìn)行突變檢測(cè)及單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析，對(duì)所發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)或單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)在患者和健康人中的分布進(jìn)行比較。 結(jié)果：本組52例患者中，未發(fā)現(xiàn)可引起氨基酸序列改變的突變位點(diǎn)，但我們發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的雜合性突變位點(diǎn)：1例患者的cDNA 621位堿基為A→T雜合性突變，但其編碼的氨基酸未發(fā)生改變，仍然為絲氨酸，為同義突變，另外，在3例患者