應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究2型糖尿病胰島素抵抗脂肪組織相關(guān)基因表達(dá)及其鑒定.pdf

1、2型糖尿病的發(fā)病率近年來在全球逐年增長(zhǎng)，在發(fā)達(dá)國(guó)家糖尿病患病率已達(dá)3-7％，成為僅次于癌腫、艾滋病、心血管病之后第4位需要優(yōu)先考慮的疾病，已成為世界第5位死亡主因，嚴(yán)重危害人民生活健康。2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，由于2型糖尿病的早期診斷至今并不理想，因此如何在分子水平探討2型糖尿病發(fā)病機(jī)制并對(duì)其進(jìn)行早期診斷及預(yù)防已成為這一領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。 胰島素抵抗為2型糖尿病的基本病理生理改變，同時(shí)也是一些代謝疾病如冠心病、高血壓、

2、肥胖及血脂異常、動(dòng)脈粥樣硬化等發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。盡管脂肪組織在外周葡萄糖利用中只占有很小的比例，但它卻在胰島素抵抗過程中發(fā)揮重要作用。胰島素抵抗是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。但即使將目前所知的環(huán)境因素均考慮在內(nèi)，也僅能解釋不到三分之一的胰島素抵抗成因。因此，遺傳因素可能是胰島素抵抗的主要原因。目前研究認(rèn)為，2型糖尿病胰島素抵抗的發(fā)生是多種相關(guān)基因表達(dá)失?；蚴Щ钏隆Ｒ寻l(fā)現(xiàn)胰島素抵抗的許多候選基因，如胰島素受體底物1，糖原合成酶，

3、UCP-3，GLUT4，己糖激酶Ⅱ，磷脂酰肌醇3-激酶，絲氨酸-蘇氨酸激酶，Rad基因與鈣調(diào)蛋白-10等。雖然已證實(shí)在2型糖尿病中確實(shí)存在這些物質(zhì)的改變，但還不清楚哪些基因是胰島素抵抗的主效基因、次效基因和微效基因。實(shí)驗(yàn)表明在2型糖尿病胰島素抵抗產(chǎn)生的復(fù)雜過程中，很可能存在著這樣相互協(xié)調(diào)的共表達(dá)的基因群體。因而將在脂肪組織中各個(gè)環(huán)節(jié)和階段共同表達(dá)的眾多基因作為一個(gè)“基因群”(genecluster)進(jìn)行研究，篩選在2型糖尿病胰島素抵抗過

4、程中的多個(gè)環(huán)節(jié)上起作用的分子和起關(guān)鍵性調(diào)控作用的基因，發(fā)現(xiàn)脂肪組織與胰島素抵抗的內(nèi)在聯(lián)系，揭示胰島素抵抗的本質(zhì)，將對(duì)于早期診斷2型糖尿病、有效地預(yù)防2型糖尿病及指導(dǎo)進(jìn)一步治療具有重要意義。 基因芯片也稱為基因微矩陣(Microarray)，是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)前沿生物技術(shù)。它在一次實(shí)驗(yàn)中可以對(duì)上萬種基因的表達(dá)水平進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)，從而達(dá)到高效率、高通量、低成本地篩查和分析差異表達(dá)基因的目的，為研究在2型糖尿病胰島素抵

5、抗過程中各個(gè)環(huán)節(jié)和階段相互協(xié)調(diào)、共同表達(dá)的基因群提供了強(qiáng)有力的工具。 [研究目的] 應(yīng)用基因芯片技術(shù)比較2型糖尿病胰島素抵抗患者與正常人大網(wǎng)膜脂肪組織相關(guān)基因表達(dá)譜的差異，以進(jìn)一步闡明胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制并探索新的治療方法。 [實(shí)驗(yàn)方法] 1、依照穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)作為胰島素抵抗(IR)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集伴IR的2型糖尿病(實(shí)驗(yàn)組)及無IR血糖正常(對(duì)照組)配對(duì)大網(wǎng)膜標(biāo)本各2例

6、，均取自外科手術(shù)患者。 2、一步法抽提大網(wǎng)膜脂肪組織總RNA，純化mRNA，將4096種人類基因PCR產(chǎn)物用Cartesian點(diǎn)樣微矩陣列點(diǎn)樣于化學(xué)涂層的載玻片上，制成基因芯片，并重復(fù)兩次；分別以Cy5和Cy3兩種熒光染料通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)將胰島素抵抗組和對(duì)照組脂肪組織的mRNA標(biāo)記成探針，并與基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交。通過GenePix4000B掃描儀掃描芯片熒光信號(hào)圖像，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件分析，尋找兩組差異表達(dá)基

7、因。 3、抽提大網(wǎng)膜脂肪組織總RNA，設(shè)計(jì)并合成雙特異性有絲分裂原激活的蛋白激酶磷酸酶4(MKP-4)、磷脂酰肌醇4-磷酸鹽5-激酶Ⅱ型β(PIP5K2B)、叉頭框C2(FOXC2)引物，分別進(jìn)行RT-PCR和Northernblot半定量分析其mRNA表達(dá)量，對(duì)基因芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 [結(jié)果] 1、按差異顯著陽性標(biāo)準(zhǔn)，通過2次基因芯片篩選，從4096個(gè)基因中篩選出在大網(wǎng)膜脂肪組織中與2型糖尿病胰島素抵抗可能相

8、關(guān)的共同差異表達(dá)的82條基因，其中42條基因表達(dá)上調(diào)(2.0倍以上)，40條基因表達(dá)下調(diào)(0.5倍以下)。差異表達(dá)基因涉及代謝，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還包括原癌與抑癌基因、離子通道與運(yùn)輸?shù)鞍谆?、凋亡基因、免疫相關(guān)基因、蛋白翻譯合成基因、細(xì)胞增殖與分化相關(guān)基因、細(xì)胞骨架組成基因等。 2、與2型糖尿病胰島素抵抗明顯相關(guān)的差異表達(dá)基因主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及代謝方面。其中，與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的MKP-4及與脂肪細(xì)胞代謝相關(guān)的叉頭框C2(FO

9、XC2)表達(dá)明顯增加，而PIP5K2B明顯減少。 3、RT-PCR顯示MKP-4在2型糖尿病胰島素抵抗患者的大網(wǎng)膜脂肪組織中高表達(dá)，PIP5K2B是低表達(dá)。Northernblot半定量研究顯示編碼FOXC2的基因在2型糖尿病胰島素抵抗大網(wǎng)膜脂肪組織中高表達(dá)。結(jié)果與基因表達(dá)譜芯片結(jié)果吻合。 [結(jié)論] 1、胰島素抵抗是2型糖尿病的基本病理生理改變。應(yīng)用基因芯片技術(shù)比較2型糖尿病伴胰島素抵抗患者與無胰島素抵抗正常對(duì)照

10、的大網(wǎng)膜脂肪組織mRNA差異表達(dá)基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)脂肪組織與胰島素抵抗機(jī)制密切相關(guān)，差異表達(dá)基因主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及代謝方面。說明2型糖尿病胰島素抵抗是多基因因素共同改變的結(jié)果，同時(shí)與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及代謝密切相關(guān)，應(yīng)用用基因芯片技術(shù)對(duì)2型糖尿病胰島素抵抗過程中的眾多基因表達(dá)方式進(jìn)行深入研究是可行的。 2、分別應(yīng)用RT-PCR對(duì)MKP-4、PIP5K2B進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)用Northernblot對(duì)FOXC2驗(yàn)證，結(jié)果與芯片掃描