IL-1β對兔髓核細胞生長及MMP-9、NGF表達的影響.pdf

1、目的:
　　通過對兔髓核細胞的培養(yǎng),探討炎性細胞因子IL-1β對兔髓核細胞生長的影響以及NGF和MMP-9蛋白表達的的影響。
　　方法:
　　1、通過培養(yǎng)兔髓核細胞,觀察其形態(tài),取對數(shù)期的髓核細胞,種植96孔板中,用MTT方法通過酶標儀檢測OD值,來探討不同濃度(10ng/ml IL-1β、20ng/ml IL-1β、40 ng/ml IL-1β、80ng/ml IL-1β)的藥物作用下髓核細胞的活力。
　　2、

2、細胞預(yù)培養(yǎng)融合達到80％后,以每孔3×105傳代至6孔板中,實驗組四孔,對照組一孔,于每孔上做好標記,培養(yǎng)24小時后更換1%胎牛血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)12小時,更換含10%胎牛血清的新培養(yǎng)基2ml;然后用40ng/ml IL-1β加入四個實驗孔,分別孵育24h、48h、72h、96h后收集細胞,提取總蛋白,同時設(shè)置空白對照組,用10%胎牛血清的新培養(yǎng)基2ml培育96h后提取蛋白,應(yīng)用Western blotting檢測同一藥物濃度下加藥后不

3、同時間MMP-9、NGF蛋白的表達。
　　3、細胞預(yù)培養(yǎng)融合達到80%后,以每孔3×105傳代至6孔板中,分成兩組:對照組l孔,試驗組4孔。培養(yǎng)24小時后更換1%胎牛血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)12小時。試驗組分別予10 ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml IL-1β含10%FBS DMEM/F12培養(yǎng)基處理,空白對照組培養(yǎng)在10%FBS DMEM/F12培養(yǎng)基中,48h后收集細胞,提取總蛋白,用蛋白免疫印跡法檢測M

4、MP-9、NGF蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1、原代髓核細胞培養(yǎng)72h后可見其逐漸貼壁,呈不規(guī)則型、長梭形,多角型,緩慢生長。5天貼壁細胞逐漸增多,大部分細胞緊貼組織塊生長,呈克隆狀分布,貼壁細胞占50-80%,呈多角形或紡錘形,未貼壁的細胞或組織逐漸表現(xiàn)呈空泡狀,250倍鏡下可見細胞輪廓清楚,扁平透亮,胞核清晰。培養(yǎng)7天后顯微鏡下見組織周圍細胞數(shù)目明顯增多,呈放射狀分布,細胞生長迅速,2周左右貼壁髓核細胞細胞逐漸融合,排

5、列緊密,呈“鋪石樣”。
　　2、MTT結(jié)果顯示:10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml IL-1β對兔髓核細胞活性無明顯影響,四組藥物處理組的細胞存活率與對照組相比無明顯差異。
　　3、IL-1β可刺激兔髓核細胞表達NGF蛋白,并且其表達量隨著IL-1β刺激時間的增加而增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);但是不同濃度的 IL-1β刺激兔髓核細胞NGF蛋白的表達量較對照組明顯升高,但各個組之間NGF

6、的表達量無明顯差異(P>0.05)。
　　4、IL-1β可刺激兔髓核細胞表達MMP-9蛋白,并且其表達量隨著IL-1β刺激時間的增加而增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);但是不同濃度的 IL-1β刺激兔髓核細胞MMP-9蛋白的表達量較對照組明顯升高,但各個組之間MMP-9的表達量無明顯差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、致炎細胞因子IL-1β能夠刺激兔髓核細胞MMP-9、NGF蛋白的表達,正常的髓核細胞MM