IL-1β對(duì)人腰椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的作用初步研究.pdf

1、[背景]椎間盤(Intervertebral Disc,IVD)是脊柱運(yùn)動(dòng)功能單位中關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)。因椎間盤退變而導(dǎo)致的椎間盤退變性疾病(Degenerative Disc Disease,DDD)已成為現(xiàn)代社會(huì)中嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的常見病。椎間盤退變是一個(gè)復(fù)雜的過程。引起椎間盤退變的原因是多方面、多層次的,生物力學(xué)改變、外傷、營(yíng)養(yǎng)障礙、炎癥反應(yīng)、基質(zhì)降解酶類的激活、生長(zhǎng)因子改變、細(xì)胞凋亡、遺傳等等眾多因素可能都是導(dǎo)致椎間盤退變的原因。近

2、年一些研究者認(rèn)為抑制了椎間盤細(xì)胞的凋亡就能阻止椎間盤退變的進(jìn)程。炎癥因子在椎間盤的退變過程中起了很大的促進(jìn)作用。已報(bào)道的在椎間盤中可檢測(cè)到的炎性因子主要有IL-1β、IL16、IL6、IL8、IL-1a、IL12和TNF-a等。最近研究還發(fā)現(xiàn),IL-1β對(duì)椎間盤細(xì)胞的凋亡也有影響。然而,IL—1β對(duì)椎間盤細(xì)胞的凋亡作用途徑尚不清楚。明確椎間盤細(xì)胞的具體凋亡途徑對(duì)于選擇阻斷這種過度凋亡的合適方法有著要重要的意義。研究IL-1β對(duì)誘導(dǎo)人髓核

3、細(xì)胞的凋亡的過程或許能為研究椎間盤退變性疾病提供些思路。
　　 [目的]本實(shí)驗(yàn)的目的是以體外培養(yǎng)腰椎間盤退變性疾病病人的髓核細(xì)胞為研究對(duì)象,摸索并比較IL-1β、IL-1a、IL-6對(duì)腰椎間盤髓核細(xì)胞的作用,尤其是IL-1β的誘導(dǎo)凋亡作用隨濃度和作用時(shí)間的變化,并證實(shí)IL-1β對(duì)人髓核細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用。
　　 [材料和方法]取腰椎間盤退變性疾病病人的髓核細(xì)胞體外培養(yǎng),(1)采用酶消化法分離人椎間盤髓核細(xì)胞,進(jìn)行單層培

4、養(yǎng),觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性,通過免疫細(xì)胞化學(xué)對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定；(2)應(yīng)用Cell Counting Kit-8試劑盒觀察IL-1β在0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL,100ng/mL濃度分別刺激0h、24h、48h、72h后對(duì)髓核細(xì)胞凋亡的影響,并與類似條件下的IL-1a、IL-6作用相比較；(3)分別采用Annexin V-FITC、碘化丙啶雙重?zé)晒馑厝旧途€粒體膜電位檢測(cè)技術(shù)觀察髓核細(xì)胞的凋亡,并用流式細(xì)胞技術(shù)統(tǒng)計(jì)

5、凋亡率。用western blot方法檢測(cè)cleaved caspase-3的表達(dá)。
　　 [結(jié)果](1)成功進(jìn)行人髓核細(xì)胞單層培養(yǎng),細(xì)胞形態(tài)為多角形；細(xì)胞具有Ⅱ型膠原的陽性表達(dá)。(2)在無血清的條件下,50ng/mL IL-1β即可對(duì)髓核細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性作用,在48h時(shí)毒性作用表現(xiàn)已做夠明顯,IL-1a、IL-6未觀察到明顯類似作用,10％的胎牛血清對(duì)IL-1β有抑制作用。(3)可觀察到IL-1β導(dǎo)致的人髓核細(xì)胞明顯凋亡；

6、可觀察到實(shí)驗(yàn)組中cleaved capase3的表達(dá),對(duì)照組陰性。
　　 [結(jié)論](1)成功培養(yǎng)人退變椎間盤髓核細(xì)胞,表型鑒定符合髓核細(xì)胞特征。(2)采用Cell Counting Kit-8試劑盒觀察到在無血清條件下IL-1β在一定濃度下即可對(duì)髓核細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性作用,IL-1a、IL-6無明顯類似作用,10％的胎牛血清對(duì)IL-1β有抑制作用。(3)運(yùn)用Annexin V-FITC、碘化丙啶雙重?zé)晒馑厝旧途€粒體膜電位檢測(cè)