IL-1β對人腰椎間盤髓核細(xì)胞凋亡的作用初步研究.pdf

1、[背景]椎間盤(Intervertebral Disc,IVD)是脊柱運(yùn)動功能單位中關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)。因椎間盤退變而導(dǎo)致的椎間盤退變性疾病(Degenerative Disc Disease,DDD)已成為現(xiàn)代社會中嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的常見病。椎間盤退變是一個復(fù)雜的過程。引起椎間盤退變的原因是多方面、多層次的,生物力學(xué)改變、外傷、營養(yǎng)障礙、炎癥反應(yīng)、基質(zhì)降解酶類的激活、生長因子改變、細(xì)胞凋亡、遺傳等等眾多因素可能都是導(dǎo)致椎間盤退變的原因。近

2、年一些研究者認(rèn)為抑制了椎間盤細(xì)胞的凋亡就能阻止椎間盤退變的進(jìn)程。炎癥因子在椎間盤的退變過程中起了很大的促進(jìn)作用。已報道的在椎間盤中可檢測到的炎性因子主要有IL-1β、IL16、IL6、IL8、IL-1a、IL12和TNF-a等。最近研究還發(fā)現(xiàn),IL-1β對椎間盤細(xì)胞的凋亡也有影響。然而,IL—1β對椎間盤細(xì)胞的凋亡作用途徑尚不清楚。明確椎間盤細(xì)胞的具體凋亡途徑對于選擇阻斷這種過度凋亡的合適方法有著要重要的意義。研究IL-1β對誘導(dǎo)人髓核

3、細(xì)胞的凋亡的過程或許能為研究椎間盤退變性疾病提供些思路。
　　 [目的]本實驗的目的是以體外培養(yǎng)腰椎間盤退變性疾病病人的髓核細(xì)胞為研究對象,摸索并比較IL-1β、IL-1a、IL-6對腰椎間盤髓核細(xì)胞的作用,尤其是IL-1β的誘導(dǎo)凋亡作用隨濃度和作用時間的變化,并證實IL-1β對人髓核細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用。
　　 [材料和方法]取腰椎間盤退變性疾病病人的髓核細(xì)胞體外培養(yǎng),(1)采用酶消化法分離人椎間盤髓核細(xì)胞,進(jìn)行單層培

4、養(yǎng),觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性,通過免疫細(xì)胞化學(xué)對細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定；(2)應(yīng)用Cell Counting Kit-8試劑盒觀察IL-1β在0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL,100ng/mL濃度分別刺激0h、24h、48h、72h后對髓核細(xì)胞凋亡的影響,并與類似條件下的IL-1a、IL-6作用相比較；(3)分別采用Annexin V-FITC、碘化丙啶雙重?zé)晒馑厝旧途€粒體膜電位檢測技術(shù)觀察髓核細(xì)胞的凋亡,并用流式細(xì)胞技術(shù)統(tǒng)計

5、凋亡率。用western blot方法檢測cleaved caspase-3的表達(dá)。
　　 [結(jié)果](1)成功進(jìn)行人髓核細(xì)胞單層培養(yǎng),細(xì)胞形態(tài)為多角形；細(xì)胞具有Ⅱ型膠原的陽性表達(dá)。(2)在無血清的條件下,50ng/mL IL-1β即可對髓核細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性作用,在48h時毒性作用表現(xiàn)已做夠明顯,IL-1a、IL-6未觀察到明顯類似作用,10％的胎牛血清對IL-1β有抑制作用。(3)可觀察到IL-1β導(dǎo)致的人髓核細(xì)胞明顯凋亡；

6、可觀察到實驗組中cleaved capase3的表達(dá),對照組陰性。
　　 [結(jié)論](1)成功培養(yǎng)人退變椎間盤髓核細(xì)胞,表型鑒定符合髓核細(xì)胞特征。(2)采用Cell Counting Kit-8試劑盒觀察到在無血清條件下IL-1β在一定濃度下即可對髓核細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性作用,IL-1a、IL-6無明顯類似作用,10％的胎牛血清對IL-1β有抑制作用。(3)運(yùn)用Annexin V-FITC、碘化丙啶雙重?zé)晒馑厝旧途€粒體膜電位檢測