基于質粒表達的siRNA對豬圓環(huán)病毒2型體內外復制的抑制效應.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩95頁未讀 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、分類號:S墨5:三密級:公玨一單位代碼:!QQ墨魚學號:2QQ墨壘魚Q基于質粒表達的siRNA對豬圓環(huán)病毒2型體內外復制的抑制效應InhibitionofPlasmidbasedsiRNAontheReplicationofPorcineCircovirusType2(PCV2)inVivoandinVitro學位申請人:李曼指導教師:宋勤葉教授學科專業(yè):預防獸醫(yī)學學位類別:農學碩士授予單位:河北農業(yè)大學答辯日期:二。一一年五月二十九日

2、\刪l㈣㈣叭㈣n㈧㈨刪噬I堅‘Y1^M‘刁V摘要豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)引起的豬圓環(huán)病毒相關疾病(PCVAD)是危害當今全球養(yǎng)豬生產的最重要的免疫抑制性疫病。目前仍沒有防治該病的理想疫苗和藥物,因此研究預防和治療PCVAD的新制劑具有重要的理論和實踐意義。RNA干擾(RNAi)是由雙鏈小干擾(siIⅢA)引起的序列特異性的轉錄后基因沉默現(xiàn)象,該技術在傳染性疾病、惡性腫瘤、心血管疾病等的治療研究領域發(fā)展極為迅速。本研究構建了PCV2特異

3、的siRNA表達質粒,分析了其對PCV2增殖和致病性的抑制作用。針對PCV2的rep和cap基因,篩選了10個siRNA靶序列,設計并合成了10對編碼PCV2特異的shRNA的DNA寡核苷酸和l對PCV2非特異(SCR)的shRNA的DNA寡核苷酸。將ll對DNA寡核苷酸退火形成雙鏈,克隆到siRNA表達質粒pGensil1的U6啟動子下游,構建了PCV2特異的siRNA表達質粒(pGensilC123、C297、C490、C563、C

4、645、R148、R259、R295、R484、R601)和對照質粒(pGensilSCR)。在脂質體介導下將構建的siRNA表達質粒轉染PK一15細胞,20h后感染500TCID50的PCV2。應用實時熒光定量PCR(RealtimeFQPCR)、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)、蛋白免疫印記(Westernblot)和免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)等技術檢測病毒DNA、mRNA及蛋白的合成與表達情況。結果表明,構建的P

5、CV2特異的siRNA表達質粒均能不同程度地抑制PCV2DNA、mRNA及Rep與Cap蛋白在PK15細胞內的合成,其中針對C297、C490和R259三個靶位的siRNA的抑制效果更好。進一步研究發(fā)現(xiàn),質粒轉染后16hfl0可抑制PCV2的復制,且直到接毒后72h仍有明顯的抑制作用;當siRNA表達質粒的轉染劑量為1pg時,病毒DNA濃度顯著低于轉染025Pg、05lag時的濃度;針對兩個或三個靶位的siRNA表達質粒混合轉染PK15

6、細胞對PCV2的抑制作用顯著增強。上述結果提示PCV2特異的siRNA表達質粒對病毒的抑制作用具有長效性和劑量依賴性,針對不同靶位的siRNA表達質?;旌限D染對PCV2具有抑制協(xié)同效應。將128只8周齡BALB/c隨機分為8組,每組16只。第l、2組分別為只感染病毒的陽性對照(PC)組和不感染病毒的陰性對照(NC)組;第3、6組分別為空質粒和SCR對照組,第4、5組為接種一種質粒組,第7、8組為兩種質?;旌辖M。其中第3~7組先接種質粒2

7、4h后感染PCV2;第8組先感染PCV2,24h后接種質粒。質粒和病毒均通過腹腔與鼻腔途徑接種,質粒接種劑量為50肛∥只,PCV2(105TCIDs401mL)的感染劑量為01mL/只。結果PCV2感染21d后,接種siRNA表達質粒的各組小鼠的體重均顯著高于PC、空質粒和SCR對照組的體重(PO05)。與PC、空質粒和SCR對照組相比,接種siRNA表達質粒組的抗體水平、血清中PCV2核酸檢出率以及組織中的PCV2載量均顯著降低(P0

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論