供體來源ImDex聯(lián)合供體抗原特異性Treg保護(hù)大鼠肝臟移植物的研究.pdf

1、背景:
　　肝臟移植是根治終末期肝病唯一有效手段，移植術(shù)后患者將面臨免疫排斥導(dǎo)致的移植物失功能和免疫抑制劑終生使用帶來高感染率、高腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)率、高昂的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)等問題。如何減少和避免免疫抑制劑的應(yīng)用，是肝臟移植研究領(lǐng)域的重要方向。免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)治療使其成為可能。而目前公認(rèn)的具有免疫調(diào)控能力的細(xì)胞為imDC和Treg。當(dāng)前認(rèn)為imDC和Treg在調(diào)控免疫中相互促進(jìn)，協(xié)同作用。已知imDC促進(jìn)Treg分化并且擴增Treg，而T

2、reg能幫助imDC保持其未分化狀態(tài)。不過總體來說imDC處于中心地位[3]。但是其受限于保存時間短，體內(nèi)易被激活成熟，因而治療性研究受到限制。可喜的是，研究發(fā)現(xiàn) DC分泌的膜性微囊—Exosome，表面富含免疫相關(guān)分子，并內(nèi)含DC所提呈的外源性抗原，甚至具有一定量的遺傳物質(zhì)，且性質(zhì)穩(wěn)定，低溫下可長久保存。為解決上述DC治療性研究受限制及誘導(dǎo)耐受效果弱等問題，文獻(xiàn)報道和前期研究都利用了供體 imDC來源的Exosome（imDex）探究

3、其保護(hù)移植物的作用。結(jié)果表明供體來源imDex可一定程度上延長鼠類心臟和小腸移植物的存活時間，且該保護(hù)效果與體內(nèi)Treg比例有密切關(guān)系。另外如需誘導(dǎo)出理想的耐受狀態(tài)還需聯(lián)合小劑量免疫抑制藥物才可行。我們猜想，與imDC相似，imDex在體內(nèi)可能也是通過擴增Treg數(shù)量和增強其功能來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)。
　　目的:
　　為了進(jìn)一步減少免疫抑制藥物的使用，并且驗證我們的猜想。我們構(gòu)建了近交系大鼠原位肝臟移植模型，在體內(nèi)外試驗中聯(lián)用供體

4、來源imDex和抗原特異性Treg，觀察二者聯(lián)用的免疫調(diào)節(jié)效果，探究imDex與Treg之間的作用關(guān)系。
　　方法:
　　以BN/F344大鼠為供體，Lewis大鼠為受體，建立大鼠原位肝臟移植模型。利用超高速梯度離心法獲得供體imDex。電子顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)對imDex進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子表型鑒定。
　　對移植受體行不同劑量imDex處理，再進(jìn)行生存分析探究其對肝臟移植物的保護(hù)作用，并探索該作用與劑量之間的關(guān)系。

5、　　利用兩步免疫磁珠分選技術(shù)分選受體脾臟來源CD4+CD25+T細(xì)胞，而后與供體抗原提呈細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得供體抗原預(yù)刺激的Treg。流式鑒定其功能分子的變化，體外實驗鑒定其免疫抑制效果。
　　不同來源和不同特異性的Treg用于移植受體，驗證抗原特異性對于Treg在移植免疫中的重要性。
　　進(jìn)一步體內(nèi)實驗中聯(lián)合imDex和Treg，應(yīng)用生存分析，組織形態(tài)學(xué)和混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)觀察兩者聯(lián)用對移植物可能的保護(hù)作用和受體體內(nèi)免疫狀態(tài)

6、的變化。
　　體外實驗探究imDex對Treg的作用，體內(nèi)實驗中，用CFSE標(biāo)記Treg聯(lián)合imDex輸注受體，觀察Treg的增殖與imDex之間的關(guān)系，驗證體外結(jié)論。
　　結(jié)果:
　　1)以超高速梯度離心法分離出較好保持了imDC表型的imDex，其最佳作用劑量為20μg。
　　2)具有供體抗原特異性 Treg對移植物的保護(hù)作用顯著高于單純磁珠分選后的自然Treg（P<0.05）。
　　3)ImDex和T

7、reg兩者聯(lián)用組生存時間長于對照組（P<0.01），聯(lián)用組受體移植物10th天和40th天免疫排斥反應(yīng)輕微，體內(nèi)T細(xì)胞增殖活性及其細(xì)胞因子分泌均減低，外源性輸注的Treg體內(nèi)出現(xiàn)顯著增殖，并且在受體移植物、脾臟、淋巴結(jié)中均有分布。
　　4)進(jìn)一步體外實驗中發(fā)現(xiàn)imDex可以擴增Treg，5th天imDex高劑量組Treg增殖比例更高，但是7th后不同劑量imDex處理Treg增殖效果相似，這提示imDex的體內(nèi)應(yīng)用可能不需要過高劑