供體來源ImDex聯(lián)合供體抗原特異性Treg保護大鼠肝臟移植物的研究.pdf

1、背景:
　　肝臟移植是根治終末期肝病唯一有效手段，移植術(shù)后患者將面臨免疫排斥導致的移植物失功能和免疫抑制劑終生使用帶來高感染率、高腫瘤發(fā)生和復發(fā)率、高昂的經(jīng)濟負擔等問題。如何減少和避免免疫抑制劑的應用，是肝臟移植研究領(lǐng)域的重要方向。免疫調(diào)節(jié)細胞的細胞學治療使其成為可能。而目前公認的具有免疫調(diào)控能力的細胞為imDC和Treg。當前認為imDC和Treg在調(diào)控免疫中相互促進，協(xié)同作用。已知imDC促進Treg分化并且擴增Treg，而T

2、reg能幫助imDC保持其未分化狀態(tài)。不過總體來說imDC處于中心地位[3]。但是其受限于保存時間短，體內(nèi)易被激活成熟，因而治療性研究受到限制?？上驳氖?，研究發(fā)現(xiàn) DC分泌的膜性微囊—Exosome，表面富含免疫相關(guān)分子，并內(nèi)含DC所提呈的外源性抗原，甚至具有一定量的遺傳物質(zhì)，且性質(zhì)穩(wěn)定，低溫下可長久保存。為解決上述DC治療性研究受限制及誘導耐受效果弱等問題，文獻報道和前期研究都利用了供體 imDC來源的Exosome（imDex）探究

3、其保護移植物的作用。結(jié)果表明供體來源imDex可一定程度上延長鼠類心臟和小腸移植物的存活時間，且該保護效果與體內(nèi)Treg比例有密切關(guān)系。另外如需誘導出理想的耐受狀態(tài)還需聯(lián)合小劑量免疫抑制藥物才可行。我們猜想，與imDC相似，imDex在體內(nèi)可能也是通過擴增Treg數(shù)量和增強其功能來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)。
　　目的:
　　為了進一步減少免疫抑制藥物的使用，并且驗證我們的猜想。我們構(gòu)建了近交系大鼠原位肝臟移植模型，在體內(nèi)外試驗中聯(lián)用供體

4、來源imDex和抗原特異性Treg，觀察二者聯(lián)用的免疫調(diào)節(jié)效果，探究imDex與Treg之間的作用關(guān)系。
　　方法:
　　以BN/F344大鼠為供體，Lewis大鼠為受體，建立大鼠原位肝臟移植模型。利用超高速梯度離心法獲得供體imDex。電子顯微鏡和流式細胞術(shù)對imDex進行形態(tài)學和分子表型鑒定。
　　對移植受體行不同劑量imDex處理，再進行生存分析探究其對肝臟移植物的保護作用，并探索該作用與劑量之間的關(guān)系。

5、　　利用兩步免疫磁珠分選技術(shù)分選受體脾臟來源CD4+CD25+T細胞，而后與供體抗原提呈細胞共培養(yǎng)，獲得供體抗原預刺激的Treg。流式鑒定其功能分子的變化，體外實驗鑒定其免疫抑制效果。
　　不同來源和不同特異性的Treg用于移植受體，驗證抗原特異性對于Treg在移植免疫中的重要性。
　　進一步體內(nèi)實驗中聯(lián)合imDex和Treg，應用生存分析，組織形態(tài)學和混合淋巴細胞培養(yǎng)技術(shù)觀察兩者聯(lián)用對移植物可能的保護作用和受體體內(nèi)免疫狀態(tài)

6、的變化。
　　體外實驗探究imDex對Treg的作用，體內(nèi)實驗中，用CFSE標記Treg聯(lián)合imDex輸注受體，觀察Treg的增殖與imDex之間的關(guān)系，驗證體外結(jié)論。
　　結(jié)果:
　　1)以超高速梯度離心法分離出較好保持了imDC表型的imDex，其最佳作用劑量為20μg。
　　2)具有供體抗原特異性 Treg對移植物的保護作用顯著高于單純磁珠分選后的自然Treg（P<0.05）。
　　3)ImDex和T

7、reg兩者聯(lián)用組生存時間長于對照組（P<0.01），聯(lián)用組受體移植物10th天和40th天免疫排斥反應輕微，體內(nèi)T細胞增殖活性及其細胞因子分泌均減低，外源性輸注的Treg體內(nèi)出現(xiàn)顯著增殖，并且在受體移植物、脾臟、淋巴結(jié)中均有分布。
　　4)進一步體外實驗中發(fā)現(xiàn)imDex可以擴增Treg，5th天imDex高劑量組Treg增殖比例更高，但是7th后不同劑量imDex處理Treg增殖效果相似，這提示imDex的體內(nèi)應用可能不需要過高劑