新西蘭雌-雄兔皮膚移植模型供體特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法的建立.pdf

1、[研究背景]
　　 器官移植后必需應(yīng)用免疫抑制劑防止急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，免疫抑制劑通過(guò)抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞等靶細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子合成而起作用。但是目前仍然無(wú)法區(qū)分移植抗原引起的免疫排斥反應(yīng)和病毒細(xì)菌感染引起的免疫反應(yīng)。理想的免疫抑制治療應(yīng)該在免疫抑制和保持免疫力間取得平衡，因此對(duì)于臨床醫(yī)生來(lái)說(shuō)移植患者管理是一件很困難的事。保存受體免疫力，盡可能減小免疫抑制劑用量或誘導(dǎo)免疫耐受一直是移植免疫學(xué)家的主要目標(biāo)，這方面雖然也取得了一

2、些令人興奮的成果，但是誘導(dǎo)耐受仍然有大量的工作要做，研究誘導(dǎo)免疫耐受方法，盡可能減小免疫抑制的用量，研究檢測(cè)免疫耐受及免疫力的免疫學(xué)方法將是今后幾年器官移植所面臨的最重要的挑戰(zhàn)。
　　 可靠的免疫狀態(tài)指標(biāo)可以為免疫抑制劑的使用提供依據(jù)，使抑制劑不僅可以根據(jù)排斥反應(yīng)的程度或耐受情況使用，還可以根據(jù)患者的易感性規(guī)范化用藥，由于長(zhǎng)期免疫抑制劑治療所引起的的高發(fā)病率和高死亡率，高度期望規(guī)范化用藥能夠?qū)崿F(xiàn)。但是，盡管通過(guò)血液標(biāo)本或移植物病

3、理分析檢測(cè)免疫功能已經(jīng)可以部分了解宿主抗移植物排斥反應(yīng)，包括了解浸潤(rùn)細(xì)胞的表型及功能，T細(xì)胞性質(zhì)的改變、細(xì)胞因子及抗體的合成情況等，但是仍然沒有一種可靠的特異的排斥反應(yīng)檢測(cè)方法。目前臨床常用受體免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)的方式仍然是臨床癥狀評(píng)估結(jié)合移植物活檢。但是，活組織病理檢查對(duì)移植物和宿主均是一種損傷性檢查，有其固有的局限性。
　　 現(xiàn)在有學(xué)者開始供體特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的研究，用帶有移植物復(fù)合抗原的供體細(xì)胞檢測(cè)受體的免疫殺傷強(qiáng)度，供

4、體細(xì)胞在受體內(nèi)受到的不僅是毒性淋巴細(xì)胞的攻擊，而且同時(shí)要受到抗體、補(bǔ)體、毒性淋巴細(xì)胞的多重攻擊，因此對(duì)移植復(fù)合抗原的定量測(cè)試不但能反映特異性CTL的活性，而且能全面的反映受體對(duì)供體的特異性免疫狀態(tài)。
　　 本課題設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單的方法，在新西蘭白兔上開展供體特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)，探索兔體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法建立的技術(shù)參數(shù)，研究體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)?zāi)芊駲z測(cè)出受體的免疫排斥狀況。用CFSE標(biāo)記供體脾細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)供體細(xì)胞在受體內(nèi)遭受

5、排斥反應(yīng)過(guò)程，同時(shí)設(shè)置受體脾細(xì)胞作為內(nèi)參照。標(biāo)記的脾細(xì)胞懸液輸注給不同的受體，輸注后不同時(shí)間點(diǎn)采血進(jìn)行流式細(xì)胞分析。我們發(fā)現(xiàn)外周血中標(biāo)記的受體細(xì)胞能在8小時(shí)內(nèi)被流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到，而不同的主要和次要組織相容性抗原的供體細(xì)胞在試驗(yàn)中消失與皮膚移植后排斥動(dòng)力學(xué)相一致。
　　 [目的]
　　 建立新西蘭白兔供體特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法，探索細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)的技術(shù)參數(shù)、羥基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)熒光染色條件、輸

6、注細(xì)胞數(shù)及確定最佳測(cè)試時(shí)間點(diǎn)，驗(yàn)證體內(nèi)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)芊駲z測(cè)出受體的免疫排斥狀況，為供體特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)。
　　 [方法]
　　 取4～6月齡清潔級(jí)雌、雄新西蘭白兔各5只，雌、雄兔各根據(jù)體重排序，根據(jù)序號(hào)雌雄兔配對(duì)，雌兔為供體，雄兔為受體，于每只雌兔背部剪下約4cm×2cm的皮膚一塊，于雄兔背部移植雌兔皮膚，并用3/0無(wú)創(chuàng)傷縫線固定皮緣，移植后2周，移植皮膚完全脫落，建立新西蘭白兔雌-雄兔皮膚移

7、植模型，為模型組。另取未作移植的雌、雄新西蘭白兔各5只，雌、雄兔各根據(jù)體重排序，根據(jù)序號(hào)雌雄兔配對(duì)，為對(duì)照組。分別于模型組及對(duì)照組配對(duì)取雌兔及雄兔脾臟，放入Hank's液中，200目不銹鋼網(wǎng)研磨法制備脾細(xì)胞懸液，7.5g/L氯化銨裂解紅細(xì)胞，0.01mol/LPBS稀釋制備脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液。雄性脾細(xì)胞用0.24μmCFSE染色，雌性脾細(xì)胞用高濃度6μmCFSE染色。每對(duì)雌、雄兔脾細(xì)胞懸液混合，制備1:1混合細(xì)胞懸液。細(xì)胞混合懸液稀釋后，

8、取1滴稀釋液和1滴0.5％錐蟲藍(lán)溶液混合，靜置3min，加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞核成藍(lán)色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量，活細(xì)胞比例達(dá)95％以上(細(xì)胞存活率=0.5％錐蟲藍(lán)染色陰性細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞/HP×100)。于模型組、對(duì)照組雄兔輸注細(xì)胞懸液，注射混合細(xì)胞總數(shù)為1×109個(gè)左右。雄兔輸注混合細(xì)胞后分別于1,2，4，8h抽取外周血，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血兩種熒光細(xì)胞的比例變化，計(jì)算供體特異性細(xì)胞殺傷率(R)=1-

9、donorcells/recipientcells×100％，比較模型組與對(duì)照組的供體特異性細(xì)胞殺傷率差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)示為(x)±s，組間殺傷率比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。
　　 [結(jié)果]
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析模型組及對(duì)照組新西蘭白兔各10只，每組分別5對(duì)雌、雄兔。全部進(jìn)入結(jié)果分析，無(wú)脫失。
　　 2.皮膚移植模型觀察結(jié)果皮膚移植后15d，移

10、植皮膚完全脫落，雌-雄兔皮膚移植排斥模型建立，皮膚病理證實(shí)。
　　 3.CFSE染色混合脾細(xì)胞懸液集中在淋巴細(xì)胞所在的小細(xì)胞區(qū)，單核細(xì)胞區(qū)也有一部分陽(yáng)性細(xì)胞，但是染色不均一，選用小淋巴細(xì)胞區(qū)作為檢測(cè)門。CFSE染色時(shí)需要較大濃度差才能完全把兩群脾細(xì)胞完全分離開，在濃度相差25倍時(shí)流式圖才顯示為兩組獨(dú)立的點(diǎn)圖，即CFSE低濃度用0.24μM，高濃度用6μM。
　　 4.流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果CFSE染色后的混合細(xì)胞在輸注前供體

11、、受體細(xì)胞各為49.79％及49.85％。移植模型組供體雌兔脾細(xì)胞在輸注后1h剩4.73％，在2～4h后剩0.30％，8h后基本清除，而同基因的雄兔脾細(xì)胞同對(duì)照組一樣緩慢下降。模型組供體特異性細(xì)胞殺傷率(R)在混合細(xì)胞輸注后1h為48.26％±2.31％，2h為64.18％±6.23％，4h為73.41％±3.87％，8h為89.66％±6.96％。而對(duì)照組殺傷率在混合細(xì)胞輸注后1h為5.49％±2.51％，2h為13.23％±2.23

12、％，4h為21.53％±2.23％，8h為31.51％±3.21％。在混合細(xì)胞輸注后的1h、2h、4h、8h，各時(shí)間點(diǎn)模型組供體特異性細(xì)胞殺傷率(R)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.284,13.624,24.215,15.146，所有P＜0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 新西蘭雌-雄兔皮膚移植模型體內(nèi)抗原特異性細(xì)胞毒性試驗(yàn)流式檢測(cè)設(shè)定在淋巴細(xì)胞門，兩種細(xì)胞CFSE的染色濃度差控制在25倍左右，輸注細(xì)胞1,

13、2h模型組殺傷率高達(dá)48.26％±2.31％，64.18％±6.23％，選擇這一時(shí)間點(diǎn)可以準(zhǔn)確判定兩組白兔所處的免疫狀態(tài)，且能滿足臨床要求的快速檢測(cè)的目的。供體特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的特點(diǎn)有:
　　 1、供體特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)是體內(nèi)試驗(yàn)，不用模擬體內(nèi)復(fù)雜的免疫環(huán)境，本身就是移植物所處的免疫環(huán)境。
　　 2、檢測(cè)方法準(zhǔn)確簡(jiǎn)單，應(yīng)用熒光標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，可準(zhǔn)確到單個(gè)細(xì)胞水平。
　　 3、檢測(cè)靶細(xì)胞為供體來(lái)源細(xì)