苯甲酸雌二醇對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用研究.pdf

1、背景和目的 缺血性腦血管病(ischemia cerebrolvascular disease，ICVD)具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點，是目前嚴重危害人類健康的主要疾病之一，隨著我國老齡化人口的增加，缺血性腦血管病發(fā)病率在不斷提高。缺血性腦血管病的神經(jīng)損傷及細胞死亡機制一直是基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點。 缺血性腦損傷的細胞死亡方式有兩種：壞死和凋亡。細胞凋亡主要發(fā)生在缺血灶周圍，參與了腦缺血再灌注損傷，并可能和缺

2、血灶的擴大有關(guān)，在缺血性腦損傷中占據(jù)重要地位。腦缺血后細胞凋亡的發(fā)生既是凋亡相關(guān)基因表達的結(jié)果，又受許多內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)，如細胞內(nèi)鈣超載、氧自由基、興奮性氨基酸、NO、炎癥介質(zhì)等。近來炎癥介質(zhì)和腦缺血再灌注后細胞凋亡的關(guān)系日益受到人們的重視，眾多學(xué)者紛紛尋求拮抗腦缺血再灌注后炎性損傷機制的核心靶點。近年發(fā)現(xiàn)，核因子-кB

3、的增強子KB序列特異結(jié)合的蛋白因子，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在哺乳動物細胞中，NF-кB/Rel家族成員主要有5個，即RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-кB1(p50/p105)、NF-кB 2(p52/p100)，其中p65含有轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域，利用其C末端的反式激活域增強靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，在細胞中最普遍，含量最豐富，它常被人們選做研究NF-кB轉(zhuǎn)錄激活功能的主要目標(biāo)。NF-кB可直接調(diào)控參與腦缺血再灌注后炎性損傷的多種介質(zhì)

4、的表達，如腫瘤壞死因子-a(tumor necrosis factor-a，TNF-a)、白細胞介素(interleukin，IL)、細胞粘附分子(cellular adhesion：molecule,ICAM-1)、血管細胞間粘附分子(vessel cellulaiadhesion molecule，VCAM-1)、誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等，因而NF-кB活化被認

5、為是介導(dǎo)或加劇腦缺血再灌注后炎性損傷的中心環(huán)節(jié)。研究表明，一氧化氮(NO)是一種兼有細胞內(nèi)和細胞間信使和神經(jīng)遞質(zhì)的氣體物質(zhì)，在腦缺血再灌注損傷中具有神經(jīng)保護和神經(jīng)毒性的雙重作用：低濃度NO起著生理信息的傳遞作用，高濃度NO則具有極強的神經(jīng)毒性作用。腦缺血后NO可通過脫氨基作用和抑制核糖核酸還原酶(DNA合成的限速酶)，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)破壞，復(fù)制與修復(fù)的抑制，而DNA的損傷又可激活多聚合酶而減少細胞基質(zhì)與ATP，快速消耗能量產(chǎn)生神經(jīng)毒性，引

6、起神經(jīng)細胞凋亡。研究顯示，NO在腦缺血早期釋放量少，亞急性期明顯增加，而誘導(dǎo)型一氧化氮合酶是介導(dǎo)此期NO合成的主要限速酶。iNOS為非鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性酶，在生理下并不表達，在病理狀態(tài)下，如發(fā)生炎癥時，在脂多糖(LPS)或某些細胞因子的刺激下，可在多種神經(jīng)細胞中誘導(dǎo)表達。iNOS一旦誘導(dǎo)合成即可持續(xù)產(chǎn)生大量NO，直至底物耗盡；而且iNOS mRNA半衰期特別長，可持續(xù)長時間翻譯合成iNOS?；谝陨咸攸c，iNOS是腦缺血后NO過量產(chǎn)

7、生的主要來源。 雌激素是一種甾體激素，雌二醇(β-estradiol，BE<,2>)是雌激素的主要成分，其生物學(xué)效能最強。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究表明，絕經(jīng)前女性較同齡男性的腦卒中發(fā)病率低，而絕經(jīng)后女性的腦卒中發(fā)病率明顯增高。臨床上使用雌激素替代療法可使發(fā)生卒中的相對危險度下降，與卒中有關(guān)的死亡率亦下降，然而雌激素對腦缺血的影響機制迄今仍不十分清楚，雌激素對腦缺血再灌注后NF-кB和iNOS表達與細胞凋亡影響的報道甚少。本實驗用線栓法

8、制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血灶周圍NF-kB p65和iNOS表達與細胞凋亡的變化及苯甲酸雌二醇的影響，探討局灶性腦缺血再灌注損傷的機制及雌激素的腦保護作用機制，為臨床治療缺血性腦血管病提供理論依據(jù)。 材料與方法 1試驗動物與分組：健康成年雄性SD大鼠24只，體重260～300g，隨機分為：假手術(shù)組、對照組(缺血2h/再灌注24h組)、雌激素組(缺血2h/再灌注24h+苯甲酸雌二醇)，每

9、組8只； 2給藥方法：雌激素組：用苯甲酸雌二醇(上海通用藥業(yè)股份公司，規(guī)格：每支2mg/1ml)按0.1ml/kg(20μg/kg)腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)7天。假手術(shù)組和對照組給予等量生理鹽水； 3模型建立：給藥7天后采用改良的Longa線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，假手術(shù)組不插線。術(shù)后觀察同側(cè)Horner氏征和對側(cè)肢體癱瘓體征以判斷模型是否成功； 4標(biāo)本制備：各組于麻醉清醒后先進行神經(jīng)功能缺損評分。缺血2

10、小時拔出線栓再灌注24小時再次麻醉，心臟灌注，多聚甲醛固定后斷頭取腦做石蠟切片，供HE染色、免疫組化及檢測凋亡細胞用； 5觀測指標(biāo)： (1)神經(jīng)功能缺損評分：比較各組神經(jīng)功能缺損情況； (2)HE染色：在顯微鏡下觀察腦組織病理學(xué)變化； (3)免疫組化：觀察各組腦缺血再灌注后NF-кB p65和iNOS表達情況； (4)TUNEL染色； 6免疫組化和TUNEL染色結(jié)果判定：免疫陽性細胞被染成

11、棕黃色，iNOS陽性細胞為胞漿著色：NF-кB p65陽性細胞的胞核和胞漿內(nèi)光鏡下可見棕黃色物質(zhì)。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性凋亡細胞。每張切片在缺血灶周圍隨機計數(shù)6個高倍鏡視野(400×)中的陽性細胞數(shù)，取平均值，分別作為NF-кB p65、iNOS、TUNEL陽性細胞數(shù)； 7統(tǒng)計方法：應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。先進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布和方差齊后，兩組均數(shù)

12、間比較采用t檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析。以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。 結(jié)果 (1)對照組和雌激素組術(shù)后出現(xiàn)左側(cè)Horner氏征，右側(cè)肢體癱瘓，以前肢為重，提尾見大鼠右前肢屈曲、內(nèi)收。假手術(shù)組僅出左側(cè)Horner氏征。說明模型復(fù)制成功； (2)各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分：假手術(shù)組：0；對照組：2.25±0.46；雌激素組：1.63±0.52。雌激素組神經(jīng)功能缺損評分明顯低于模型組(P<0.05)，說明苯甲

13、酸雌二醇能夠能夠減輕大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損； (3)HE染色：腦組織切片HE染色：假手術(shù)組無梗死灶。對照組有明顯的梗死灶，光鏡下可見大量深染的神經(jīng)元細胞核，核固縮、偏位、致密，胞漿嗜酸性增加；壞死中心區(qū)可見神經(jīng)細胞壞死，神經(jīng)元外形不易辨認，大部分細胞結(jié)構(gòu)消失，胞漿空泡樣變性，壞死灶內(nèi)大量膠質(zhì)細胞增生。壞死邊緣區(qū)可見細胞核固縮明顯，核深染，胞漿嗜酸性明顯增多。雌激素組梗死灶不明顯，多數(shù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較完整，形態(tài)相對正常，間質(zhì)水

14、腫輕。說明苯甲酸雌二醇能夠改善大鼠缺血再灌注后腦組織的病理變化，對腦缺血再灌注損傷有保護作用； (4)NF-кB p65表達情況：各組NF-KB p65陽性細胞數(shù)：假手術(shù)組為2.25±0.64；對照組為32.08±4.32；雌激素組為23.73±4.16。和假手術(shù)組比較，對照組NF-кB表達明顯增加(P<0.01)；而雌激素組NF-кB表達較對照組明顯減少(P<0.01)。說明大鼠腦缺血再灌注后NF-кB表達增加，而雌激素能夠抑制大鼠腦

15、缺血再灌注后NF-кB的表達； (5)iNOS表達情況：各組.iNOS陽性細胞數(shù)：假手術(shù)組為2.15±0.69；對照組為26.34±3.73；雌激素組為17.85±3.07。和假手術(shù)組比較，對照組iNOS表達明顯增加(P<0.01)；而雌激素組iNOS表達較對照組明顯減少(P<0.01)。說明大鼠腦缺血再灌注后iNOS表達增加，而苯甲酸雌二醇能夠抑制大鼠腦缺血再灌注后iNOS的表達； (6)TUNEL染色：假手術(shù)組未見凋

16、亡細胞；對照組凋亡細胞數(shù)為38.58±4.05；雌激素組為28.34±3.33。雌激素組與對照組比較凋亡細胞明顯減少(P<0.05)。說明大鼠腦缺血再灌注后凋亡細胞增多，雌激素能夠減少腦缺血再灌注細胞凋亡的發(fā)生。 結(jié)論 (1)NF-кB和iNOS參與了腦缺血再灌注損傷的病理生理過程； (2)苯甲酸雌二醇能夠減輕大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損和腦組織病理結(jié)構(gòu)損傷，其機制可能是通過抑制腦缺血再灌注后NF-кB和iNO