山羊β—乳球蛋白調(diào)控序列及增強(qiáng)子序列共指導(dǎo)人胰島素原基因表達(dá)的研究.pdf

1、利用人胰島素原基因組DNA與山羊乳蛋白調(diào)控序列、增強(qiáng)子序列以及新霉素抗性基因共同組成乳腺特異性表達(dá)載體，將此構(gòu)件轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞，經(jīng)激素誘導(dǎo)獲得了表達(dá)重組人胰島素的山羊乳腺上皮細(xì)胞系，從而為制備乳腺特異性表達(dá)轉(zhuǎn)基因山羊奠定了基礎(chǔ)。 一、乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建 人胰島素原基因組DNA，以人的全血基因組DNA為模板經(jīng)高保真PCR擴(kuò)增獲得，長(zhǎng)度為1.2Kb，包含信號(hào)肽序列、A、B、C肽鏈序列DNA；β-乳球蛋白(BLG)

2、基因調(diào)控序列，以薩能奶山羊基因組為模板經(jīng)高保真長(zhǎng)PCR擴(kuò)增獲得，其中5'端長(zhǎng)度為4.2Kb，3'端長(zhǎng)度為1.8Kb；增強(qiáng)子序列為600bp左右，富含細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)DNA序列以及NEOr新霉素抗性基因。通過(guò)以上元件，成功構(gòu)建了奶山羊β-乳球蛋白調(diào)控序列及增強(qiáng)子序列共同指導(dǎo)人胰島素原基因乳腺特異性表達(dá)載體BIC13。 二、山羊乳腺上皮細(xì)胞系的建立與藥物篩選 采用膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法從處于泌乳狀態(tài)的薩能奶山羊的乳腺組

3、織中分離得到原代乳腺上皮細(xì)胞，將乳腺特異性表達(dá)載體片段BLG5'-Enhancer-hPI-NEOr-BLG3'(9.7Kb)電轉(zhuǎn)染入第四代奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，經(jīng)含400μg/mlG418的篩選培養(yǎng)液篩選三周后，得到10個(gè)有抗性的細(xì)胞株。提取細(xì)胞基因組，經(jīng)PCR擴(kuò)增表明，其中有6個(gè)細(xì)胞株成功轉(zhuǎn)染了外源基因。 三、陽(yáng)性乳腺上皮細(xì)胞系的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè) 對(duì)轉(zhuǎn)染有外源基因的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)用催乳素誘導(dǎo)表達(dá)，48小時(shí)后提取