甘蔗乙烯受體基因SoERS1表達(dá)、轉(zhuǎn)化及啟動(dòng)子序列的研究.pdf

1、甘蔗為重要的糖料作物和經(jīng)濟(jì)作物，通過培育新品種，結(jié)合栽培技術(shù)來提高甘蔗糖分、產(chǎn)量、抗逆性，是甘蔗糖業(yè)的主要發(fā)展方向。乙烯在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有重要調(diào)節(jié)作用，對(duì)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其相關(guān)基因已有不少研究，獲得了多個(gè)受體基因，但對(duì)受體基因調(diào)控機(jī)理尚未清楚。乙烯利能夠顯著提高甘蔗的產(chǎn)量、蔗糖分、抗逆性，但其作用分子機(jī)理也未明確。因此，本實(shí)驗(yàn)以新臺(tái)糖22號(hào)為材料，進(jìn)行了甘蔗乙烯受體基因SoERS1表達(dá)、遺傳轉(zhuǎn)化和啟動(dòng)子序列研究。主要結(jié)果如下:<

2、br>　　 1.SoERS1表達(dá)分析。在伸長(zhǎng)期和工藝成熟期，葉片中SoERS1基因的表達(dá)為成熟葉＞幼葉＞老葉。在蔗莖中，老莖的表達(dá)量大于幼莖和成熟莖，伸長(zhǎng)期成熟莖大于幼莖，而工藝成熟期成熟莖低于幼莖。在生理成熟期甘蔗不同組織部均能檢測(cè)到SoERS1基因的表達(dá)，說明該基因可能為組成型表達(dá)模式。干旱脅迫和黑暗條件下可以抑制成熟葉中SoERS1基因的表達(dá);100 mg/L乙烯利處理伸長(zhǎng)期甘蔗，成熟葉中SoERS1在第1d基因表達(dá)量急劇升高。

3、在苗期進(jìn)行6℃低溫脅迫，葉中SoERS1的表達(dá)先降后升，低溫脅迫后恢復(fù)生長(zhǎng)2d，基因的表達(dá)回升。
　　 2.植物表達(dá)載體構(gòu)建。根據(jù)本課題組前期從新臺(tái)糖20號(hào)(ROC20)中克隆出甘蔗乙烯受體基因(GQ369007)序列，在其編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異引物，并從新臺(tái)糖22號(hào)(ROC22)中克隆到ERS基因完整編碼框序列，基因命名SoERS1。在上、下游引物分別加XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建SoERS1正義表達(dá)載體pBIERS。利用軟件Si

4、RNATarget Finder預(yù)測(cè)和分析SoERS1基因siRNA干擾片段，最終選定編碼區(qū)前403 bp，將該片段分別正向、反向插入中間載體176中，再用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切中間載體176，將目的片段切下連接到表達(dá)載體pCAMBIA1300上，把目的基因連接到pCAMBIA1300，構(gòu)建了RNAi干擾載體p1300ERS。
　　 3.SoERS1遺傳轉(zhuǎn)化和原核表達(dá)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，把pBIERS轉(zhuǎn)入煙草k346，PC

5、R檢測(cè)目的片段與載體GFP基因序列，確認(rèn)甘蔗SoERS1基因已經(jīng)整合到煙草基因組DNA中，轉(zhuǎn)化效率為61％。對(duì)苗期轉(zhuǎn)基因煙草噴施200 mg/L的乙烯利可以提高煙草葉片的乙烯釋放速率。
　　 構(gòu)建的非融合原核表達(dá)載體pETERS1和融合原核表達(dá)載體pETERS2在原核菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)均不能表達(dá)，這可能與該基因序列中稀有密碼子含量較高，或酶蛋白自身某些特性不適合在原核細(xì)胞里表達(dá)有關(guān)。
　　

6、4.SoERS1啟動(dòng)子序列克隆和分析。采用基于熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR原理的染色體步移技術(shù)，克隆甘蔗SoERS1基因上游啟動(dòng)子序列，得到位于翻譯起始密碼子ATG之前的序列1410bp，在GeneBank登錄號(hào)為KC862312。該序列與玉米ERS25和玉米ERS14核苷酸同源性分別為82％和80％。利用PlantCARE和PLACE在線預(yù)測(cè)該啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)該序列除了含有啟動(dòng)子基本作用元件CAAT-box和TATA-box之外，還含有多個(gè)特