前列腺素E-,2-調(diào)控膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究.pdf

1、前列腺素是廣泛存在于人類、哺乳動(dòng)物組織和體液中的一組重要的活性物質(zhì)，幾乎參與了所有細(xì)胞的代謝活動(dòng)，并且與炎癥、免疫、腫瘤等重要病理過(guò)程有關(guān)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝上具有重要作用。除紅細(xì)胞外，全身各組織均有合成前列腺素的酶系，目前發(fā)現(xiàn)有兩種環(huán)加氧酶(COX-1和COX-2)與前列腺素的合成有關(guān)。COX-1在大多數(shù)組織中呈低水平持續(xù)表達(dá)，與維持正常組織細(xì)胞的生理功能有關(guān)；而COX-2的表達(dá)則被嚴(yán)格控制，在大多數(shù)生理?xiàng)l件下不表達(dá)，只有在病理?xiàng)l件下，因

2、為某些細(xì)胞因子、有絲分裂原等誘導(dǎo)才會(huì)迅速表達(dá)。研究表明，前列腺素合成的限速酶COX-2在人類的腫瘤和炎癥組織中高表達(dá)，COX-2基因敲除或應(yīng)用COX-2選擇性抑制劑可抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤的發(fā)生和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和血管生成也與COX-2產(chǎn)生的高水平PGE<,2>密切相關(guān)。這些研究表明COX-2及其誘導(dǎo)的PGE<,2>在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。 PGE<,2>是環(huán)加氧酶作用于花生四烯酸后的主要產(chǎn)物之一，是

3、與炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)、創(chuàng)傷愈合等過(guò)程密切相關(guān)的重要介質(zhì)，通過(guò)自分泌或旁分泌的形式發(fā)揮其生物學(xué)功能。阿司匹林和其他非類固醇類抗炎藥物主要是通過(guò)抑制COX-2活性和PGE<,2>合成發(fā)揮其作用的。流行病學(xué)和臨床實(shí)驗(yàn)研究表明長(zhǎng)期使用阿司匹林和其他非類固醇類抗炎藥物可以降低多種腫瘤的發(fā)病率。這些研究讓人們對(duì)COX-2和PGE<,2>在腫瘤形成過(guò)程中的作用產(chǎn)生了濃厚的興趣。 PGE<,2>主要是通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)的EP1、EP2、EP3和EP4受體相互

4、作用發(fā)揮其生理作用。EP受體為7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，受體胞外結(jié)構(gòu)域識(shí)別胞外信號(hào)分子并與之結(jié)合，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與G蛋白偶聯(lián)。EP受體通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)，調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使，從而將胞外信號(hào)跨膜傳遞到胞內(nèi)。不同EP受體亞型與不同的G蛋白亞型相偶聯(lián)。通過(guò)大鼠和人胚腎細(xì)胞EP受體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，人們推測(cè)四種EP受體可能是通過(guò)以下信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用的：EP1受體與G蛋白的Gq部分偶聯(lián)，通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和激活蛋白激酶C而發(fā)揮作用，促

5、進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；EP<,2>和EP<,4>受體與G蛋白的Gs部分偶聯(lián)，EP<,2>受體通過(guò)激活腺苷酸環(huán)化酶/促進(jìn)cAMP生成/激活蛋白激酶A而發(fā)揮作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；EP<,4>受體除了通過(guò)激活腺苷酸環(huán)化酶/促進(jìn)cAMP生成/激活蛋白激酶A而發(fā)揮作用，還通過(guò)激活磷脂酰肌醇3-激酶/激活蛋白激酶B等途徑發(fā)揮作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；EP3受體與G蛋白的Gi部分偶聯(lián)，通過(guò)抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性而發(fā)揮作用。近年來(lái)許多研究表明COX-2/PGE<

6、,2>在疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，但是PGE<,2>影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的確切信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍然不十分清楚。因此研究PGE<,2>調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)研究腫瘤發(fā)生機(jī)制及尋找新的腫瘤治療靶點(diǎn)具有重要意義。 研究目的： 1.觀察前列腺素EP受體在膽管上皮癌細(xì)胞HuCCT1、SG231和CCLPl中的表達(dá)情況。 2.檢測(cè)PGE<,2>和EP受體對(duì)三株膽管癌細(xì)胞增殖的影響。 3.明確PGE<,2>調(diào)

7、控膽管癌細(xì)胞增殖是否涉及Erk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 4.研究PGE<,2>對(duì)第二信使鈣離子的影響，探明細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變?cè)贓P受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。 5．初步探索與PGE<,2>促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖相關(guān)的EP受體及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 研究方法： 1.常規(guī)方法培養(yǎng)膽管上皮癌細(xì)胞HuCCT1、SG231和CCLP1。 2.用RT-PCR和western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三株膽管癌細(xì)胞E

8、P受體表達(dá)類型。 3.用WST實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PGE<,2>、Erk抑制劑PD98059、EP受體選擇性激動(dòng)劑17-P-T-PGE<,2>和EP受體選擇性抑制劑SC51322對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)率的影響。 4.用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)PGE<,2>、EP1受體選擇性激動(dòng)劑17-P-T-PGE<,2>和EP1受體選擇性抑制劑SC51322對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。 5.Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膽管上皮癌細(xì)胞中相關(guān)信

9、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白磷酸化水平變化情況。 6.使用EP1受體選擇性激動(dòng)劑17-P-T-PGE<,2>和抑制劑SC51322檢測(cè)EP1受體在相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。 7.使用細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM和EGFR抑制劑AGl478，以明確細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高及EGFR在相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。 研究結(jié)果： 1.RT-PCR和westem blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，膽管癌細(xì)胞HuCCT1、SG231和CCLP1均

10、表達(dá)EP1、EP2、EP3和EP4四種EP受體。 2.WST實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示PGE<,2>、EP1受體激動(dòng)劑17-P-T-PGE<,2>可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)，EP1受體選擇性抑制劑SC51322可抑制PGE<,2>促起的膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)。 3.激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明：PGE2、EP1受體激動(dòng)劑17-P-T-PGE<,2>可促進(jìn)膽管癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，EP1受體選擇性抑制劑SC51322可抑制PGE<,2>引起的細(xì)胞內(nèi)

11、鈣離子濃度升高。 4.Erk抑制劑PD98059可抑制PGE<,2>引起的膽管癌細(xì)胞增值。 5.PGE<,2>、EP1受體激動(dòng)劑17-P-T-PGE<,2>可引起膽管癌細(xì)胞內(nèi)Erk磷酸化水平升高，EP1受體選擇性抑制劑SC51322可抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的Erk磷酸化。 6.細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM可抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的EGFR磷酸化。 7.細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM可抑制PGE<

12、,2>誘導(dǎo)的Erk磷酸化，AGl478(EGFR抑制劑)可抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的Erk磷酸化。 8.細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM可抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的Akt磷酸化，AGl478(EGFR抑制劑)可抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的Akt磷酸化。 研究結(jié)論：在膽管癌細(xì)胞中，除了Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路外，PGE<,2>引起的膽管癌細(xì)胞增殖還與Erk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活相關(guān)，并且第二信使鈣離子在其中起著及其重要的作用。PGE<,2>