前列腺素E-,2-調(diào)控膽管癌細(xì)胞生長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究.pdf

1、前列腺素是廣泛存在于人類、哺乳動物組織和體液中的一組重要的活性物質(zhì)，幾乎參與了所有細(xì)胞的代謝活動，并且與炎癥、免疫、腫瘤等重要病理過程有關(guān)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝上具有重要作用。除紅細(xì)胞外，全身各組織均有合成前列腺素的酶系，目前發(fā)現(xiàn)有兩種環(huán)加氧酶(COX-1和COX-2)與前列腺素的合成有關(guān)。COX-1在大多數(shù)組織中呈低水平持續(xù)表達，與維持正常組織細(xì)胞的生理功能有關(guān)；而COX-2的表達則被嚴(yán)格控制，在大多數(shù)生理條件下不表達，只有在病理條件下，因

2、為某些細(xì)胞因子、有絲分裂原等誘導(dǎo)才會迅速表達。研究表明，前列腺素合成的限速酶COX-2在人類的腫瘤和炎癥組織中高表達，COX-2基因敲除或應(yīng)用COX-2選擇性抑制劑可抑制實驗動物腫瘤的發(fā)生和腫瘤細(xì)胞的生長。腫瘤細(xì)胞的分化、生長和血管生成也與COX-2產(chǎn)生的高水平PGE<,2>密切相關(guān)。這些研究表明COX-2及其誘導(dǎo)的PGE<,2>在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。 PGE<,2>是環(huán)加氧酶作用于花生四烯酸后的主要產(chǎn)物之一，是

3、與炎癥、細(xì)胞生長、創(chuàng)傷愈合等過程密切相關(guān)的重要介質(zhì)，通過自分泌或旁分泌的形式發(fā)揮其生物學(xué)功能。阿司匹林和其他非類固醇類抗炎藥物主要是通過抑制COX-2活性和PGE<,2>合成發(fā)揮其作用的。流行病學(xué)和臨床實驗研究表明長期使用阿司匹林和其他非類固醇類抗炎藥物可以降低多種腫瘤的發(fā)病率。這些研究讓人們對COX-2和PGE<,2>在腫瘤形成過程中的作用產(chǎn)生了濃厚的興趣。 PGE<,2>主要是通過與G蛋白偶聯(lián)的EP1、EP2、EP3和EP4受體相互

4、作用發(fā)揮其生理作用。EP受體為7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，受體胞外結(jié)構(gòu)域識別胞外信號分子并與之結(jié)合，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與G蛋白偶聯(lián)。EP受體通過與G蛋白偶聯(lián)，調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生第二信使，從而將胞外信號跨膜傳遞到胞內(nèi)。不同EP受體亞型與不同的G蛋白亞型相偶聯(lián)。通過大鼠和人胚腎細(xì)胞EP受體轉(zhuǎn)染實驗，人們推測四種EP受體可能是通過以下信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用的：EP1受體與G蛋白的Gq部分偶聯(lián)，通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和激活蛋白激酶C而發(fā)揮作用，促

5、進細(xì)胞生長；EP<,2>和EP<,4>受體與G蛋白的Gs部分偶聯(lián)，EP<,2>受體通過激活腺苷酸環(huán)化酶/促進cAMP生成/激活蛋白激酶A而發(fā)揮作用，促進腫瘤細(xì)胞生長；EP<,4>受體除了通過激活腺苷酸環(huán)化酶/促進cAMP生成/激活蛋白激酶A而發(fā)揮作用，還通過激活磷脂酰肌醇3-激酶/激活蛋白激酶B等途徑發(fā)揮作用，促進腫瘤細(xì)胞生長；EP3受體與G蛋白的Gi部分偶聯(lián)，通過抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性而發(fā)揮作用。近年來許多研究表明COX-2/PGE<

6、,2>在疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，但是PGE<,2>影響腫瘤細(xì)胞生長的確切信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍然不十分清楚。因此研究PGE<,2>調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對研究腫瘤發(fā)生機制及尋找新的腫瘤治療靶點具有重要意義。 研究目的： 1.觀察前列腺素EP受體在膽管上皮癌細(xì)胞HuCCT1、SG231和CCLPl中的表達情況。 2.檢測PGE<,2>和EP受體對三株膽管癌細(xì)胞增殖的影響。 3.明確PGE<,2>調(diào)

7、控膽管癌細(xì)胞增殖是否涉及Erk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 4.研究PGE<,2>對第二信使鈣離子的影響，探明細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變在EP受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。 5．初步探索與PGE<,2>促進膽管癌細(xì)胞增殖相關(guān)的EP受體及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 研究方法： 1.常規(guī)方法培養(yǎng)膽管上皮癌細(xì)胞HuCCT1、SG231和CCLP1。 2.用RT-PCR和western blotting實驗檢測三株膽管癌細(xì)胞E

8、P受體表達類型。 3.用WST實驗檢測PGE<,2>、Erk抑制劑PD98059、EP受體選擇性激動劑17-P-T-PGE<,2>和EP受體選擇性抑制劑SC51322對細(xì)胞生長率的影響。 4.用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測PGE<,2>、EP1受體選擇性激動劑17-P-T-PGE<,2>和EP1受體選擇性抑制劑SC51322對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。 5.Western blotting實驗檢測膽管上皮癌細(xì)胞中相關(guān)信

9、號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白磷酸化水平變化情況。 6.使用EP1受體選擇性激動劑17-P-T-PGE<,2>和抑制劑SC51322檢測EP1受體在相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。 7.使用細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM和EGFR抑制劑AGl478，以明確細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高及EGFR在相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。 研究結(jié)果： 1.RT-PCR和westem blot實驗檢測結(jié)果表明，膽管癌細(xì)胞HuCCT1、SG231和CCLP1均

10、表達EP1、EP2、EP3和EP4四種EP受體。 2.WST實驗檢測顯示PGE<,2>、EP1受體激動劑17-P-T-PGE<,2>可促進膽管癌細(xì)胞生長，EP1受體選擇性抑制劑SC51322可抑制PGE<,2>促起的膽管癌細(xì)胞生長。 3.激光共聚焦掃描顯微鏡檢測結(jié)果表明：PGE2、EP1受體激動劑17-P-T-PGE<,2>可促進膽管癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，EP1受體選擇性抑制劑SC51322可抑制PGE<,2>引起的細(xì)胞內(nèi)

11、鈣離子濃度升高。 4.Erk抑制劑PD98059可抑制PGE<,2>引起的膽管癌細(xì)胞增值。 5.PGE<,2>、EP1受體激動劑17-P-T-PGE<,2>可引起膽管癌細(xì)胞內(nèi)Erk磷酸化水平升高，EP1受體選擇性抑制劑SC51322可抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的Erk磷酸化。 6.細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM可抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的EGFR磷酸化。 7.細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM可抑制PGE<

12、,2>誘導(dǎo)的Erk磷酸化，AGl478(EGFR抑制劑)可抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的Erk磷酸化。 8.細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM可抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的Akt磷酸化，AGl478(EGFR抑制劑)可抑制PGE<,2>誘導(dǎo)的Akt磷酸化。 研究結(jié)論：在膽管癌細(xì)胞中，除了Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路外，PGE<,2>引起的膽管癌細(xì)胞增殖還與Erk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活相關(guān)，并且第二信使鈣離子在其中起著及其重要的作用。PGE<,2>