微粒體前列腺素E合酶1調(diào)控EP2受體促進(jìn)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建并鑒定微粒體前列腺E合酶1(mPGES1)過(guò)表達(dá)慢病毒載體;觀(guān)察mPGES1基因過(guò)表達(dá)后對(duì)肝癌細(xì)胞Huh-7體外增殖、遷移侵襲以及體內(nèi)成瘤能力的影響;檢測(cè)過(guò)表達(dá)或下調(diào)mPGES1對(duì)肝癌細(xì)胞中前列腺素E2(PGE2)及其受體EP1、EP2、EP3和EP4表達(dá)水平的影響。探討mPGES1調(diào)控PGE2及其受體的信號(hào)途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的可能機(jī)制。
　　方法:
　　(1)通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增目的基因mPGES1全

2、長(zhǎng)。純化、酶切后與GV287載體連接得到目的基因重組質(zhì)粒,與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝生產(chǎn)mPGES1過(guò)表達(dá)慢病毒載體(pGC-LV-mPGES1-GFP)。低溫超速濃縮病毒液并檢測(cè)病毒滴度。
　　(2)使用構(gòu)建的pGC-LV-mPGES1-GFP感染Huh-7細(xì)胞(過(guò)表達(dá)組),并設(shè)pGC-LV-NC-GFP(空載體組)組和未感染組。采用PCR、Westernblot等方法鑒定mPGES1基因過(guò)表達(dá)后的mRNA、蛋

3、白表達(dá)水平。采用MTT方法、基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)mPGES1基因過(guò)表達(dá)前后Huh-7細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲以及細(xì)胞周期的變化;將三組細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下,觀(guān)察各組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況;第21d取瘤,肉眼和鏡下觀(guān)察移植瘤形態(tài)差別。
　　(3)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Elisa法)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或下調(diào)mPGES1后肝癌細(xì)胞Huh-7或HepG2中PGE2表達(dá)水平變化,real-timePCR和

4、Westernblot檢測(cè)過(guò)表達(dá)或下調(diào)mPGES1后肝癌細(xì)胞Huh-7或HepG2中PGE2受體EP1、EP2、EP3和EP4表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:
　　(1)成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)mPGES1的慢病毒載體(pGC-LV-mPGES1-GFP),測(cè)定病毒生物學(xué)滴度為2×108TU/mL。
　　(2)與空載體組、未感染組相比,過(guò)表達(dá)組的mPGES1mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高。
　　(3)與空載體組、未感染組相比,過(guò)表達(dá)

5、mPGES1的Huh-7細(xì)胞體外增殖、黏附、侵襲和遷移能力均不同程度升高。
　　(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)mPGES1的Huh-7細(xì)胞處于S期的比例高于空載體組和未感染組。
　　(5)裸鼠移植瘤模型建立過(guò)程中,過(guò)表達(dá)組移植瘤生長(zhǎng)速度較其他兩組快;接種后21d收獲移植瘤,過(guò)表達(dá)組移植瘤體積及重量均大于其他兩組。
　　(6)與空載體組、未感染組相比,過(guò)表達(dá)mPGES1后Huh-7細(xì)胞中PGE2表達(dá)水平明顯升高;PG

6、E2的EP2表達(dá)水平明顯升高,EP1、EP3和EP4表達(dá)三組中無(wú)明顯差異。
　　(7)與LV-mPGES1-NC組、control組相比,LV-mPGES1-shRNA下調(diào)mPGES1后HepG2細(xì)胞中PGE2表達(dá)水平明顯下降;PGE2的EP2表達(dá)水平明顯下降,EP1、EP3和EP4表達(dá)三組中無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)mPGES1的慢病毒載體(pGC-LV-mPGES1-GFP),高效轉(zhuǎn)染Huh-