前列腺素e2對成骨細胞力學(xué)敏感性的調(diào)控作用

1、<p>　　前列腺素E2對成骨細胞力學(xué)敏感性的調(diào)控作用</p><p>　　龔嘯元1，2，楊柳2，潘君1</p><p>　?。?重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044）</p><p>　?。?第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，重慶 400038）</p><p><b>　　摘要</b></p>

2、<p>　　目的：骨組織的大小、形狀以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)與其所受到的力學(xué)刺激有著極為密切的關(guān)系。PGE2能夠通過調(diào)控骨生成作用與骨消融作用之間的平衡而促進骨密度的增加，但其細胞學(xué)機理尚不明了。本研究試圖將PGE2與成骨細胞力學(xué)敏感性進行聯(lián)系，為解答PGE2在骨組織中促合成作用提供重要的細胞學(xué)基礎(chǔ)。</p><p>　　方法：本研究采用了胞內(nèi)鈣離子實時觀測方法記錄MC3T3-E1細胞中鈣離子濃度的變化。通過使用

3、dmPGE2對細胞進行15分鐘的預(yù)處理，并觀察其對鈣離子信號的調(diào)控作用；采用PKA信號通路的激活及與阻滯劑檢驗PKA信號通路在dmPGE2對細胞鈣離子信號調(diào)控過程中的參與作用。</p><p>　　結(jié)果：dmPGE2能夠提升MC3T3-E1細胞的力學(xué)敏感性；PKA信號通路在此過程中起參與作用。</p><p>　　結(jié)論：結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，我們認為dmPGE2通過PKA信號通路調(diào)控細

4、胞骨架中的微絲強度，增強了MSCC的開放程度，繼而增強了成骨細胞的力學(xué)敏感性。本研究的結(jié)論為解釋PGE2在骨組織中的促合成作用提供重要的細胞學(xué)基礎(chǔ)。提示PGE2可能成為治療骨合成相關(guān)疾病的潛在目標(biāo)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：力學(xué)刺激；成骨細胞；力學(xué)敏感性；細胞骨架</p><p>　　________________</p><p>　　作者簡介：龔嘯元、男、博

5、士研究生、生物力學(xué)、發(fā)表論文數(shù)量：3、聯(lián)系方式（電話：18716427965、E-mail: sliegxy@gmail.com）</p><p>　　[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(11272366; 11172207; 10972243)；重慶大學(xué)“生物流變科學(xué)與技術(shù)”教育部重點實驗室訪問學(xué)者基金（No. CQKLBST-2012-002）</p><p>　　通訊作者：潘君、聯(lián)

6、系電話：18983399552、E-mail: panj@cqu.edu.cn</p><p>　　PGE2 Modulated Mechanosensitivity in Osteoblasts</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Objective: The size, shape and intern

7、al structure of bone is highly related to its mechanical environment. It is also known PGE2 promotes bone formation by modulating the balance between bone formation and resorption. But the underlying cellular mechanism r

8、emains unknown. In the present study, we set out to address this question by connecting the PGE2 treatment and mechanosensitivity of osteoblasts.</p><p>　　Methods: The intracellular calcium response was reco

9、rded by real-time calcium imaging. The modulation of PGE2 in calcium response was examined by PGE2 pre-treatment. The involvement of PKA was examined by its activator and inhibitor.</p><p>　　Results: dmPGE2

10、is able to promote the mechanosensitivity in MC3T3-E1 cells; and PKA was involved in this process.</p><p>　　Conclusion: Combined with our previous studies, we speculate when cells are treated with dmPGE2, ac

11、tivated PKA negatively regulates F-actin intensity, increases MSCC opening, and thus increases the mechanosensitivity in MC3T3-E1 cells.</p><p>　　Key words:mechanical loading; osteoblasts; mechanosensitivity

12、; cytoskeleton</p><p>　　Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China(11272366; 11172207; 10972243); Visiting Scholar Foundation of Key Laboratory of Biorheological Sc

13、ience and Technology (Chongqing University), Ministry of Education）（No. CQKLBST-2012-002)</p><p>　　Corresponding author:Jun Pan, Tel: 18983399552, E-mail: panj@cqu.edu.cn</p><p><b>　　引言<

14、;/b></p><p>　　骨組織的大小、形狀以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)與其所受到的力學(xué)刺激有著極為密切的關(guān)系。力學(xué)刺激能夠促使骨合成作用，抑制骨消融作用，從而達到增加骨密度的作用[1]。前列腺素E2（PGE2），作為一種多功能的調(diào)控分子，被普遍認為在炎癥產(chǎn)生[2]，疼痛傳導(dǎo)[3]以及癌癥發(fā)展[4]中起重要調(diào)控作用。在骨組織中，PGE2能夠通過調(diào)控骨生成作用與骨消融作用之間的平衡而促進骨密度的增加[5]。既往研究表明不

15、同濃度的PGE2通過分別激活蛋白激酶A（PKA）信號通路以及蛋白激酶C（PKC）信號通路調(diào)控靜態(tài)培養(yǎng)成骨細胞的分化與增值[6,7]。然而，PGE2與力學(xué)加載的交互作用對成骨細胞力學(xué)敏感性的調(diào)控尚不明確。闡明該機理能夠為解答PGE2在骨組織中促合成作用提供重要的細胞學(xué)基礎(chǔ)。</p><p>　　成骨細胞，作為骨組織內(nèi)調(diào)控骨基質(zhì)生成的重要成員[8]，與骨細胞共同構(gòu)成了骨組織內(nèi)的三維力學(xué)傳導(dǎo)系統(tǒng)[9,10]。力學(xué)刺激通

16、過激發(fā)成骨細胞內(nèi)的一系列生物學(xué)效應(yīng)，如胞內(nèi)鈣離子濃度的迅速變化（胞內(nèi)鈣離子信號）[11]，一氧化氮的釋放[12]，細胞骨架的重組，細胞硬度的增加[13]，Ⅱ型環(huán)氧化合酶表達的增加，前列腺素的釋放[14]，Ⅰ型膠原蛋白合成[15]來達到促進成骨樣分化的效果。其中，最早產(chǎn)生的胞內(nèi)鈣離子信號作為第二信使參與了后續(xù)生物學(xué)效應(yīng)的調(diào)控過程。因此被普遍認為是細胞力學(xué)敏感性的指標(biāo)之一。</p><p>　　本研究中，我們通過使用

17、胞內(nèi)鈣離子作為力學(xué)敏感性的指標(biāo)，檢測PGE2對成骨細胞力學(xué)敏感性的調(diào)控作用。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p>　?。ㄒ唬?、主要實驗試劑與儀器</p><p>　　主要實驗試劑包括胎牛血清（Gibico）、α-MEM（Sigma）、青鏈霉素混合液（Sigma）、胰蛋白酶（Hyclone）、Ⅰ型膠原（Hyclone）

18、、16,16-二甲基前列腺素E2（dmPGE2，Cayman）、8-溴腺苷-3,5-環(huán)單磷酸鈉（8br-cAMP，Sigma）、蛋白激酶A多肽阻滯劑（PKI, Promega）、Fura-2 AM（Invitrogen）。主要實驗儀器包括注射器泵（Harvard，Apparatus）、鈣離子信號檢測系統(tǒng)（Intracellular Imaging）。</p><p><b>　　（二）、細胞培養(yǎng)<

19、/b></p><p>　　MC3T3-E1細胞購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫，使用含有10%胎牛血清以及1%青鏈霉素混合液的α-MEM，于37°C含有5%二氧化碳/95%空氣的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。當(dāng)細胞增殖至90%融合時對細胞進行傳代，3-10代的MC3T3-E1細胞被用于實驗。</p><p>　?。ㄈ晒馊旧?，藥物處理以及細胞加載</p><p>

20、　　由于細胞水腫脹模型能夠較好的模擬力學(xué)刺激對細胞的作用，并且具有操作簡單以及可重復(fù)性高等優(yōu)點[16,17]。因此，本研究采用水腫脹加載對成骨細胞進行刺激并觀測胞內(nèi)鈣離子信號。MC3T3-E1細胞按照初始密度（4×104 cell/ml）接種于經(jīng)過Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)皿中，當(dāng)細胞增殖至80%融合時對細胞進行細胞水腫脹加載，具體方法如下：使用Fura-2 AM（0.67mM）對細胞進行30 min的避光孵育（37°C）。

21、使用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗多余染料后，保留1 ml PBS并將培養(yǎng)皿移置熒光顯微鏡載物臺上，靜置30 min以消除染色過程中對細胞的擾動。隨后在靜態(tài)條件下對細胞分別進行15 min的空白試劑（10 μl雙蒸水）、dmPGE2（10 nM）、8br-cAMP（100 μM）、dmPGE2 + PKI（10 μM）、或8br-cAMP + PKI處理。于藥物處理結(jié)束后，使用注射器泵緩慢加入1 ml的雙蒸水至培養(yǎng)皿中，并記錄相應(yīng)的鈣離子濃

22、度變化。</p><p><b>　　（四）、數(shù)據(jù)分析</b></p><p>　　本研究使用Excel對獲得的胞內(nèi)鈣離子濃度變化數(shù)據(jù)進行處理：鈣離子響應(yīng)曲線中峰值除以基線平均值得到的倍數(shù)被定義為平均胞內(nèi)鈣離子信號強度（Mean Peak [Ca2+]i Response）；Mean Peak [Ca2+]i Response≥ 2時認為細胞響應(yīng)；響應(yīng)細胞的數(shù)量除以細

23、胞總數(shù)的百分比被定義為響應(yīng)率（Percentage of Responding Cells）；同一實驗組平均鈣離子響應(yīng)曲線中加載初始點至峰值的線性擬合斜率被定義為響應(yīng)速率（Responding Rate）</p><p>　　實驗經(jīng)過三次獨立的重復(fù)；數(shù)據(jù)表達方式為mean ± SD；使用卡方檢驗對響應(yīng)率數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P < 0.05時認為具有顯著性差異；使用One-way Anova以及bo

24、nferronia校正對胞內(nèi)鈣離子信號強度數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P < 0.05時認為具有顯著性差異。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　（一）、dmPGE2增加成骨細胞的力學(xué)敏感性</p><p>　　如圖1所示，水腫脹刺激促使空白處理組中MC3T3-E1細胞迅速產(chǎn)生胞內(nèi)鈣離子響應(yīng)（圖1A）。而相對于空白組中的

25、細胞，15 min的dmPGE2預(yù)處理明顯提升了細胞中由同等強度水腫脹脹刺激誘導(dǎo)的鈣離子信號（圖1B）。</p><p>　　圖1. dmPGE2對成骨細胞胞內(nèi)鈣離子信號的提升作用。</p><p>　?。╠mPGE2 Increases Intracellular Calcium Response in MC3T3-E1 Cells）</p><p>　　如表1所

26、示，通過對實驗數(shù)據(jù)的分析，得出具體的實驗數(shù)據(jù)：空白處理組（Untreated Cells）中，MC3T3E-1細胞的響應(yīng)率為61.2 ± 12.9%；胞內(nèi)鈣離子信號強度為4.07 ± 0.34；響應(yīng)速率為2.66 nM/second。而dmPGE2處理組中（dm PGE2 Pretreated cells），細胞的響應(yīng)率以及胞內(nèi)鈣離子信號強度分別顯著提升至86.5 ± 5.8%與5.4 ± 0.3

27、9（Pa? 0.05）；響應(yīng)速率提升至6.19 nM/second。提示dmPGE2能夠提升MC3T3-E1細胞的力學(xué)敏感性。</p><p>　　表1. dmPGE2對成骨細胞胞內(nèi)鈣離子信號的提升作用。</p><p>　　（dmPGE2 Increases IntracellularCalcium Response in MC3T3-E1 Cells）</p><p

28、>　?。ǘ?、PKA信號通路在PGE2提升胞內(nèi)鈣離子信號過程中的參與作用</p><p>　　為了驗證PKA信號通路在PGE2處理過程中的參與作用，我們分別使用PKA信號通路的激活劑8br-cAMP以及多肽阻斷劑PKI對細胞進行處理（圖2）。結(jié)果表明，8br-cAMP模擬了dmPGE2對細胞力學(xué)敏感性的提升作用（圖2A）。而PKI的加入在一定程度上抑制了dmPGE2對細胞力學(xué)敏感性的提升作用（圖2B）；同樣

29、，8br-cAMP對細胞力學(xué)敏感性的提升作用也同樣被PKI阻斷。</p><p>　　圖2. PKA信號通路在dmPGE2提升胞內(nèi)鈣離子信號過程中的參與作用。</p><p>　?。═he Involvement of PKA Pathway in dmPGE2 Induced Intracellular Calcium Response Augment）</p><p

30、>　　如表2所示，通過對實驗數(shù)據(jù)進行分析我們得出具體數(shù)據(jù)：8br-cAMP處理組中（8br-cAMP Pretreated Cells），MC3T3E-1細胞的響應(yīng)率為81.1 ± 3.6%（比較空白組，Pa? 0.05）；胞內(nèi)鈣離子信號強度為5.31 ± 0.42（比較于空白組，Pa? 0.05）；響應(yīng)速率為3.30 nM/second。dmPGE2與PKI共處理組中（dmPGE2+PKI Pretreate

31、d Cells），相對于dmPGE2處理組，細胞的響應(yīng)率以及胞內(nèi)鈣離子信號強度分別顯著降低至69.7 ± 10.1%以及3.32 ± 0.20（比較dmPGE2處理組，Pb? 0.05）；響應(yīng)速率則降低至1.45 nM/second。8br-cAMP與PKI共處理組（8br-cAMP +PKI Pretreated Cells）中，相對于8br-cAMP處理組，細胞的響應(yīng)率以及胞內(nèi)鈣離子信號強度分別顯著降低至77.5

32、 ± 6.9%以及3.75 ± 0.36（比較8br-cAMP處理組，Pc? 0.05）響應(yīng)速率則降低至1.42 nM/second。提示PKA信號參與了dmPGE2對成骨</p><p>　　表2. PKA信號通路在dmPGE2提升胞內(nèi)鈣離子信號過程中的參與作用。</p><p>　?。═he Involvement of PKA Pathway in dmPGE2

33、Induced Intracellular Calcium Response Augment）</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　骨組織通過調(diào)控骨生成作用與骨消融作用之間的平衡來適應(yīng)其作出的力學(xué)環(huán)境。成骨細胞作為骨組織內(nèi)重要的力學(xué)感應(yīng)單元，在受到生理水平的力學(xué)刺激時，通過提高堿性磷酸酶活性[18]，增加Ⅰ型膠原分泌[15]以及胞外鈣沉積作用

34、[18]調(diào)控骨生成作用。力學(xué)刺激作用于成骨細胞表面，使得細胞產(chǎn)生微小形變，促使位于細胞膜表面的力學(xué)敏感型鈣離子通道（MSCC）的開放[11,19]，引發(fā)胞外鈣離子的內(nèi)流以及細胞膜內(nèi)外電勢差，繼而激活同樣位于細胞膜表面的電壓敏感型鈣離子通道（VSCC）[20]。VSCC的開放促使細胞向胞外釋放三磷酸腺苷（ATP）[21]，并由此引發(fā)細胞內(nèi)鈣池中的鈣離子向細胞質(zhì)中的釋放[11,22]，共同構(gòu)成了胞內(nèi)鈣離子信號。胞內(nèi)鈣離子信號，作為細胞受到力

35、學(xué)刺激后首先產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，在力學(xué)信號向生物信號的翻譯過程中起到重要的傳導(dǎo)作用。由此可見，成骨細胞在受到力學(xué)刺激時的形變能力在一定程度上決定了細胞的力學(xué)敏感性。研究表明，甲狀旁腺素（PTH）,一種促進成骨細胞骨樣分化的信號分子，能夠通過降低細胞骨架中微絲的強度來增加MSCC的開放程度，繼而增強了成骨細胞的力學(xué)敏感性[23]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)P</p><p>　　PKA信號通路廣泛參與了細胞力學(xué)敏感性的調(diào)控過

36、程。既往研究表明，PKA信號通路的激活能夠提升成骨細胞在受到流體剪應(yīng)力加載時產(chǎn)生的胞內(nèi)鈣離子信號[24]，并且在流體剪應(yīng)力引發(fā)的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路的激活過程中起傳導(dǎo)作用[25]。本研究中，通過使用PKA信號通路的激活劑以及阻滯劑，我們發(fā)現(xiàn)PKA信號通路同樣參與了dmPGE2對成骨細胞力學(xué)敏感性的提升過程。有研究表明，PKA信號通路能夠通過調(diào)控微絲結(jié)構(gòu)繼而調(diào)控成骨細胞形態(tài)[26]。后續(xù)的研究表明，PKA信號通路通過抑制小

37、G蛋白超家族成員A（RhoA）活性降低微絲強度[27]。結(jié)合本研究未發(fā)表數(shù)據(jù)表明的PGE2對力學(xué)加載后成骨細胞微絲強度的降低作用，我們猜想PGE2或許通過類似于PTH的作用機理，即降低微絲強度，軟化成骨細胞，增加MSCC開放的途徑來達到提升細胞力學(xué)敏感性的效果。</p><p>　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了PGE2能夠提升MC3T3-E1細胞的力學(xué)敏感性；PKA信號通路在此過程中起參與作用。本研究的結(jié)論為解答PGE

38、2在骨組織中促合成作用提供重要的細胞學(xué)基礎(chǔ)。</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　本課題組感謝國家自然科學(xué)基金資助項目(11272366; 11172207; 10972243)；重慶大學(xué)“生物流變科學(xué)與技術(shù)”教育部重點實驗室訪問學(xué)者基金資助（No. CQKLBST-2012-002）對本項目的資助。</p><p>

39、<b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] Honda A, Sogo N, Nagasawa S, et al. High-impact exercise strengthens bone in osteopenic ovariectomized rats with the same outcome as Sham rats [J]. J Appl Physiol, 2003

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