過表達(dá)CsMADSs擬南芥植株的表型變化及其表達(dá)分析.pdf

1、MADS-box家族基因是一類編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，在植物生長發(fā)育過程中起重要的作用。如在植物根的營養(yǎng)吸收、春化、開花時間、分生組織分化、胚的發(fā)育及果實成熟等方面起著作用。近年來已發(fā)現(xiàn)MADS-box基因在植物花色素苷合成、抗逆性、根結(jié)構(gòu)、芽的休眠、甚至葉片的發(fā)育方面都發(fā)揮著重要作用。本論文克隆黃瓜的CsMADSs（CsMADS08、CsMADS21）基因，研究其在煙草細(xì)胞中的定位情況，構(gòu)建過表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥，分子檢測及篩選

2、獲得轉(zhuǎn)基因植株，對轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行GUS染色及表型變化分析，同時檢測CsMADSs基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，結(jié)果如下:
　　1、pCAMBIA1305-CsMADSs過表達(dá)載體的構(gòu)建。BamH I-Sal I雙酶切pMD19-T-CsMADSs質(zhì)粒，Sal I-BglⅡ雙酶切pCAMBIA1305植物表達(dá)載體。T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)PCR檢測和測序驗證獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA1305-CsMADSs。

3、>　　2、CsMADSs的亞細(xì)胞定位。重組質(zhì)粒pCAMBIA1305-CsMADSs凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，取2ml處理液注射煙草幼嫩葉片，注射后36-48h，熒光共聚焦顯微鏡觀察CsMADS08、CsMADS21在煙草中的瞬時表達(dá)情況，結(jié)果表明，CsMADS08定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上，而CsMADS21定位于細(xì)胞膜上。
　　3、轉(zhuǎn)基因后代表型變化分析。采用花序浸染法將過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)化擬南芥，潮霉素篩選和PCR驗證獲得陽性植株

4、，觀察轉(zhuǎn)基因后代植株各器官的生長發(fā)育情況。結(jié)果表明，過表達(dá)植株均出現(xiàn)葉片發(fā)紫現(xiàn)象;過表達(dá)CsMADS08植株，株型較矮，蓮座葉側(cè)枝減少，且出現(xiàn)大量的莖生葉，果莢數(shù)減少;在T4代出現(xiàn)了表型分離，一部分出現(xiàn)前面的表型，另一部分植株分枝數(shù)增加，果莢數(shù)多。而過表達(dá)CsMADS21植株，蓮座葉側(cè)枝及莖生葉側(cè)枝都增加，花期提前一周，果莢數(shù)多且飽滿，成熟期提早。
　　4、過表達(dá)植株的GUS染色。對過表達(dá)CsMADS08及CsMADS21植株各器

5、官進(jìn)行GUS染色，結(jié)果表明，過表達(dá)CsMADS08植株的根被染色，而過表達(dá)CsMADS21植株的根、莖、花、葉、果莢均被染色。
　　5、過表達(dá)植株的花青素含量變化。提取過表達(dá)植株及野生型植株葉片的花青素，結(jié)果顯示過表達(dá)植株葉片的花青素含量都比野生型高，達(dá)到顯著差異。
　　6、實時熒光定量檢測目的基因的表達(dá)量。提取T3代植株各器官總RNA，實時熒光定量PCR檢測CsMADSs基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，過表達(dá)CsMADS08植株