體外培養(yǎng)VSMC骨架蛋白表達(dá)變化與表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究.pdf

1、研究目的：通過(guò)對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth MuscleCells．VSMCs)體外不同條件的培養(yǎng)，檢測(cè)其細(xì)胞增殖、表型基因SM22α和骨架蛋白表達(dá)的變化，探討細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖與細(xì)胞骨架蛋白變化之間的關(guān)系，為研究VSMC細(xì)胞骨架重構(gòu)在相關(guān)疾病中的作用提供新依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)分組體外貼壁法培養(yǎng)大鼠腹主動(dòng)脈VSMCs，實(shí)驗(yàn)分別取2代(p2)，4代(p4)，6代(p6)細(xì)胞。每代細(xì)胞貼壁后用0.5

2、％NSC DMEM培養(yǎng)液同步化處理24h后，試驗(yàn)分組：血清組：同步化后細(xì)胞用12％NSC的DMEM培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞；血清饑餓組：同步化后細(xì)胞用12％NSC的DMEM培養(yǎng)72h，細(xì)胞處在合成期，再血清饑餓48h，收集細(xì)胞。各組細(xì)胞用考馬斯亮藍(lán)觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，用電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，用熒光免疫組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞骨架，用5-BrDU標(biāo)記細(xì)胞增殖情況，用RT-PCR檢測(cè)VSMC表型標(biāo)志基因SM22α的表達(dá)。每代細(xì)胞做同樣的試驗(yàn)。

3、 5-BrDU免疫組織化學(xué)染色每組各取3張圓玻片做免疫組織化學(xué)，具體步驟如下：將細(xì)胞載玻片用0.01％PBS沖洗后，用含0.3％雙氧水的甲醇封閉40 min;2N鹽酸37℃1h；正常養(yǎng)血清封閉20min，以上各步之間用0.01％PBS沖洗3次。5-BrDU抗體(1:300)4℃過(guò)夜；二抗(1：50)37℃ 30min SABC 37℃(20mim;DAB顯色3min，以上各步之間用0.01％PBS沖洗3次。脫水，二甲苯透明，封片顯微鏡

4、下觀察。每張切片都進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞以-x±S表示，用t檢驗(yàn)有顯著性差異。 熒光免疫組織化學(xué)染色每組各取3張細(xì)胞載玻片做免疫組織化學(xué)，步驟如下：將細(xì)胞載玻片用0.01％PBS沖洗后，用0.3％Triton-100封閉30min正常養(yǎng)血清封閉40min；一抗體(1:400)4℃過(guò)夜；二抗(1:500)37℃60min；液體石蠟油封片，熒光顯微鏡下觀察，并進(jìn)行光密度分析，每組以平均光密度置分析，用t檢驗(yàn)有顯著性差異。

5、 RT-PCR檢測(cè)將上述試驗(yàn)收集的細(xì)胞用一步法(Tfizol試劑)提取總RNA，在20ul反應(yīng)體系中42℃ 50 min，70℃ 15min，逆轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3ul加入聚合酶連反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)體系，在50ul反應(yīng)體系中進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。聚合酶鏈反應(yīng)：94℃變性50s,57℃退火50s，72℃延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，同一試驗(yàn)重復(fù)

6、3次。 電鏡將細(xì)胞按電鏡方法包埋和切片，在透視電鏡下觀察。 結(jié)果 一、VSMC增殖的變化免疫組織化學(xué)染色顯示：隨培養(yǎng)代數(shù)增加，標(biāo)記的增殖細(xì)胞越多，第6代標(biāo)記的增殖細(xì)胞最多。血清饑餓組較血清培養(yǎng)組的VSMC標(biāo)記的增殖細(xì)胞明顯減少。 二、表型基因SM22a表達(dá)變化RT-PCR結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)的VSMC低代數(shù)(p2)細(xì)胞血清培養(yǎng)時(shí)SM22a基因有微量表達(dá)，隨著代數(shù)的增加SM22a的mRNA的表達(dá)水平逐漸降低

7、，至第6代(P6)幾乎不表達(dá)。這表明在體外培養(yǎng)的VSMC隨代數(shù)的增多，細(xì)胞的表型也逐漸有收縮型變?yōu)楹铣尚?。血清饑餓后，SM22a的mRNA水平迅速上升，但隨培養(yǎng)代數(shù)的增加該基因表達(dá)水平逐漸降低。血清因素對(duì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化起重要作用；血清饑餓能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞表型，但隨培養(yǎng)代數(shù)的增加這種逆轉(zhuǎn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用逐漸降低。 三、細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)的變化熒光免疫組織化學(xué)染色顯示，血清培養(yǎng)條件下SMa-actin隨培養(yǎng)代數(shù)的增加其表達(dá)減少，血清饑餓培養(yǎng)

8、SMa-actin表達(dá)上調(diào)。但隨培養(yǎng)代數(shù)的增加，其表達(dá)減少，至第6代僅有少量細(xì)胞表達(dá)。血清培養(yǎng)條件下隨培養(yǎng)代數(shù)的增加β-Tubulin和Desmin表達(dá)減少，血清饑餓后上調(diào)也不明顯，至第6代基本不表達(dá)。血清饑餓后細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)增多，但在高代數(shù)時(shí)血清饑餓不能逆轉(zhuǎn)β-Fubulin和Desmin的重新表達(dá)。 四、超微結(jié)構(gòu)的變化電鏡下觀察到血清培養(yǎng)組胞漿中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體等細(xì)胞器增多，有大量的分泌小泡：血清饑餓組胞漿中內(nèi)質(zhì)

9、網(wǎng)、線粒體和高爾基體等細(xì)胞器明顯減少。隨培養(yǎng)代數(shù)的增加，第8代與第3代相比，胞漿內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分泌小泡均增多，呈明顯的合成型特征。 結(jié)論 1.血清培養(yǎng)隨細(xì)胞代數(shù)的增多，細(xì)胞表型標(biāo)志基因SM22a及細(xì)胞骨架蛋白SM-a-actin、β-Tubulin和Desmin表達(dá)逐漸減少、細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，至第6代SM22a、β-Tubulin和Desmin表達(dá)消失。 2.血清饑餓培養(yǎng)能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞表型基因SM22a及細(xì)胞骨架

10、蛋白SM-a-actin、β-rublin和Desmin表達(dá)，但至第6代不能逆轉(zhuǎn)β-Tubulin和Desmin的表達(dá)。 3.β-Tubulin和Desmin在傳代培養(yǎng)第6代表達(dá)消失，并血清饑餓培養(yǎng)也不能逆轉(zhuǎn)。提示：β-Tubulin和Desmin可作為分泌型病理性增殖VSMC的的鑒定標(biāo)志。 4.VSMC表型、增殖和骨架蛋白表達(dá)之間存在內(nèi)在的聯(lián)系，它們?cè)诰S持細(xì)胞形態(tài)、收縮功能和血管重構(gòu)方面可能起了重要作用。但它們之間的因