沙門氏菌間接ELISA抗體檢測方法的建立及重組豬痘活載體疫苗的研制.pdf

1、沙門氏菌（Salmonella）是一類重要的腸道致病菌，會導(dǎo)致動物的腹瀉、腸炎、敗血癥及母畜流產(chǎn)，同時也會感染人，對畜禽養(yǎng)殖及公共衛(wèi)生意義重大。沙門氏菌包含腸道沙門氏菌和邦戈?duì)柹抽T氏菌2個種，以及7個亞種乖2500多種血清型，我國已報道其中的292種血清型，絕大多數(shù)都具有致病性。種類繁多的血清型給沙門氏菌病的診斷和防控帶來很大難度?，F(xiàn)有的沙門氏菌抗體檢測方法在效果上不甚滿意，因此挖掘診斷靶點(diǎn)、建立新型診斷技術(shù)對該病的防治很有必要。本研究

2、從沙門氏菌的抗體檢測方法和疫苗兩方面入手，以期為沙門氏菌病的預(yù)防和控制提供幫助。本文研究內(nèi)容如下:
　　1.基于外膜蛋白PagC的沙門氏菌間接ELISA抗體檢測方法的建立與應(yīng)用
　　本試驗(yàn)通過生物信息學(xué)比對和后期試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)外膜蛋白PagC廣泛存在于沙門氏菌各血清型中，在沙門氏菌屬屬內(nèi)高度保守、屬間特異，確定其適合作為沙門氏菌診斷抗原建立間接ELISA抗體檢測方法。將去除信號肽序列的pagC基因克隆至原核表達(dá)載體pET-2

3、8a中，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-pagC，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到重組蛋白PagC，用凝膠過濾和親和層析先后對其進(jìn)行純化。以純化的重組蛋白PagC作為檢測抗原建立間接ELISA方法，對該方法的各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定ELISA最佳條件為:包被抗原濃度為2μg/mL，待檢血清稀釋度為1∶50，最佳封閉液是5％脫脂奶粉，待檢血清作用時間是60 min，HRP標(biāo)記抗雞二抗的稀釋度是1∶1000，二抗作用時

4、間是60 min。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，建立的方法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，對主要血清型沙門氏菌均適用等特點(diǎn)。該ELISA方法與Biochek公司的豬沙門氏菌抗體檢測試劑盒符合率為83％，與雞白痢雞傷寒玻板凝集試驗(yàn)方法符合率為80.6％，與人工感染制備得到的29份雞白痢標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、31份標(biāo)準(zhǔn)陰性血清結(jié)果比較符合率為98.3％。用該方法對482份豬臨床血清進(jìn)行檢測，總體陽性率為46.7％，感染主要以母豬和種公豬為主;對252份雞臨床血清進(jìn)行檢測，總

5、體陽性率為42.9％。
　　2.表達(dá)沙門氏菌外膜蛋白L(OmpL)的重組豬痘病毒活載體疫苗的研制及免疫評價
　　本試驗(yàn)選取了沙門氏菌的保護(hù)性抗原ompL，將其插入豬痘病毒基因組內(nèi)，構(gòu)建了重組豬痘病毒rSPV-OmpL。通過PCR、Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)，證明該重組病毒可以正確、穩(wěn)定表達(dá)外源基因ompL。用rSPV-OmpL、沙門氏菌滅活疫苗（陽性對照）、SPV親本病毒（陰性對照）及PBS(空白對照)分別免

6、疫小鼠，其中rSPV-OmpL組的血清OmpL特異性抗體效價顯著高于陽性對照組（P＜0.05），血清IFN-γ和IL-4水平顯著高于三個對照組(P＜0.05)。致死劑量鼠傷寒沙門氏菌腹腔注射后，rSPV-OmpL組有80％小鼠存活，極顯著高于陰性對照組(P＜0.01)。說明重組豬痘病毒rSPV-OmpL作為沙門氏菌候選疫苗具有良好的應(yīng)用潛力。
　　3.共表達(dá)沙門氏菌OmpL和FliC的重組豬痘病毒的構(gòu)建及其在小鼠模型中的保護(hù)效率研

7、究
　　為了進(jìn)一步開發(fā)優(yōu)良的沙門氏菌疫苗，本試驗(yàn)在構(gòu)建好的重組豬痘病毒rSPV-OmpL的基礎(chǔ)上，再插入沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC，構(gòu)建共表達(dá)沙門氏菌OmpL和FliC的重組豬痘病毒rSPV-OF。通過PCR、Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)，證明該重組病毒rSPV-OF可以同時正確、穩(wěn)定地表達(dá)外源基因ompL和fliC。用重組病毒rSPV-OF、沙門氏菌滅活疫苗（陽性對照）、SPV親本病毒（陰性對照）及PBS（空白對