HTLV-1 HBZ對cyclin D1表達的調控作用和HTLV-1 ELISA檢測方法的建立.pdf

1、背景與目的:
　　人類T淋巴細胞白血病病毒（human T-lymphotropic virus，HTLV）是最早發(fā)現(xiàn)的人類逆轉錄病毒，主要包括四種亞型，其中HTLV-1和HTLV-2二者的基因水平70％同源。成人T細胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)和HTLV-1相關性脊髓病/熱帶痙攣性下肢輕癱(HTLV-1 assoeiated myelopathy/Tropical SPastioparapare

2、sis，HAM/TSP)是主要的HTLV-1感染相關性疾病。HTLV-1和HTLV-2可通過垂直途徑，性接觸和腸道外途徑（血液傳播和靜脈用藥）進行傳播，在全球均有流行。HTLV-1主要流行于日本、加勒比地區(qū)，中美洲和南美洲及中非西非等地區(qū)。HTLV-2流行主要是印第安人群和某些中非部落，以及歐洲和北美的某些特定人群。我國屬于HTLV非流行區(qū)，自1985年來開展過幾次HTLV流行調查，感染率為0.06％-1.27％，流行區(qū)域主要分布于東南

3、沿海地區(qū)。但對于人口大省的河南和湖北，對HTLV感染及流行的研究報道較少。由于不同地域的病毒株之間存在差異，目前的HTLV-1檢測方法均存在一定的假陽性或假陰性問題。
　　HBZ是近年來在HTLV-1感染細胞中發(fā)現(xiàn)的一種由基因組負鏈或互補鏈編碼產生的病毒蛋白，在大部分ATL細胞中成陽性表達，可以抑制Tax介導的病毒基因表達。HBZ還能通過它的bZIP結構域，與宿主的多種bZIP因子相互作用，從而改變下游基因轉錄活性，被認為在HTL

4、V-1致病機制上起著重要作用。但HBZ在HTLV-1感染細胞中的致瘤作用機制還需進一步探討。
　　本研究以HBZ病毒蛋白為對象，研究HBZ對293T細胞周期蛋白cyclin D1表達的影響，并以HBZ為基礎，初步建立了HTLV-1的ELISA檢測方法，最后，對華中地區(qū)不同人群中的HTLV1/2感染情況作了流行病學調查。為了解HBZ在細胞周期進程中的作用機制，改進HTLV-1篩查方法，以及了解河南湖北兩省HTLV感染流行狀況，提供了

5、一定的實驗基礎和理論依據(jù)。
　　第一部分 HBZ通過與轉錄因子CREB相互作用抑制cyclin D1表達
　　方法:
　　1.擴增全長HBZ、HBZ-AD以及HBZ-bZIP三個片段，分別克隆入慢病毒載體LV5，包裝純化重組慢病毒;分別將三個慢病毒感染293T細胞，CEM細胞及Jurkat細胞，建立穩(wěn)定表達HBZ三個片段的細胞系。
　　2.RT-PCR和Western Blot檢測293T-HBZ細胞、CEM-H

6、BZ細胞及Jurkat-HBZ細胞中cyclin D1的mRNA水平和蛋白質水平。
　　3.構建cyclin D1啟動子全長及包含不同轉錄因子區(qū)域的五個報告基因載體，檢測表達不同HBZ片段的細胞中cyclin D1啟動子的活性狀況。
　　4.提取空白293T細胞及293T-HBZ細胞總蛋白，利用anti-HA抗體進行免疫共沉淀(ColP)，再利用anti-CREB抗體通過Western Blot檢測HBZ與CREB間在體內的

7、相互關系。
　　5.構建CREB的原核表達載體pGEX-2T-CREB，利用誘導、表達、純化獲得的融合蛋白GST-CREB與HBZ進行GST pull-down，檢測HBZ與CREB間在體外的相互關系。
　　6.構建HBZ-bZIP的原核表達載體pGEX-2T-HBZ-bZIP，利用誘導純化的GST-HBZ-bZIP融合蛋白進行GST pull-down，檢測HBZ-bZIP和HBZ-AD與CREB間在體外的相互關系。

8、>　　結果:
　　1.HBZ、HBZ-AD、HBZ-bZIP三個重組慢病毒載體經酶切和測序鑒定正確;三個重組慢病毒感染、篩選得到穩(wěn)定表達HBZ、HBZ-AD、HBZ-bZIP的細胞株。
　　2.RT-PCR和Western Blot結果均顯示，與空白293T細胞相比，293T-HBZ細胞和293T-HBZ-bZIP細胞中cyclin D1基因表達水平顯著降低。說明HBZ的bZIP結構域可以降低細胞中cyclin D1轉錄和表

9、達水平。
　　3.將cyclin D1全長啟動子報告基因載體pGL3-CD1轉染空白CEM細胞、CEM-HBZ細胞、CEM-HBZ-AD細胞及CEM-HBZ-bZIP細胞后，表達HBZ和HBZ-bZIP的細胞中cyclin D1啟動子活性降低。當報告基因載體中啟動子片段長度包含CRE位點時（CD2和CD3），細胞中啟動子活性無明顯下降;而當刪除CRE位點后(CD4)，空白細胞和HBZ-AD細胞中啟動子活性下降約50％，說明CRE位

10、點是cyclin D1啟動子上的一個重要轉錄因子。
　　4.CoIP結果顯示，利用anti-HA抗體對293T-HBZ細胞總蛋白進行沉淀獲得的復合物中，可以檢測到CREB;利用GST-CREB融合蛋白進行GST pull-down實驗結果說明CREB和HBZ蛋白在體外可以直接結合。
　　5.進一步GST pull-down實驗結果顯示，GST-CREB融合蛋白可以與HBZ-bZIP相互結合，而GST-HBZ-bZIP融合蛋白

11、也可以與CREB相互結合;GST-CREB融合蛋白可以與HBZ相互結合，但不與HBZ-AD相互結合。
　　第二部分以HBZ為抗原的HTLV-1 ELISA檢測方法的初步建立
　　方法:
　　1.PCR擴增HBZ目的基因，克隆入T載體，酶切鑒定后，亞克隆入原核表達載體pET-29a，經PCR鑒定、酶切鑒定及測序鑒定后，構建HBZ原核表達載體。
　　2.通過IPTG誘導HBZ蛋白表達，并利用His標簽通過Ni2+親和

12、層析柱純化蛋白，SDS-PAGE電泳及Western Blot鑒定后，對目的蛋白進一步進行透析純化。
　　3.以HBZ蛋白為抗原包被酶標板，以親和素標記的HBZ蛋白為酶標抗原，利用雙抗原夾心法檢測血清標本中的相應抗體，優(yōu)化反應條件，建立HTLV-1 ELISA檢測方法。
　　4.通過對標準血清、臨床血清的檢測，與其他商品試劑盒的比較，以及穩(wěn)定性檢測，對該ELISA檢測方法進行評價。
　　結果:
　　1.PCR擴增

13、得到HBZ片段，酶切鑒定及測序鑒定證實得到重組原核表達質粒pET-29a-HBZ。
　　2.通過IPTG誘導后，SDS-PAGE電泳顯示25kD處特異性條帶;經過Ni2+親和層析柱對表達蛋白進行純化后，SDS-PAGE電泳顯示25kD處單純條帶;Western Blot結果顯示純化后的HBZ蛋白具有良好的抗原性。
　　3.純化HBZ蛋白標記生物素后，經親和素鑒定酶標抗原活性良好;確定使用30μl標本，并采用“三步法”的反應模

14、式檢測40min，可獲得較好的檢測效果。
　　4.對參比血清的檢測結果顯示該ELISA方法具有較好的檢測效果;穩(wěn)定性檢測結果顯示該ELISA檢測試劑具有較好的穩(wěn)定性;對臨床血清標本的檢測，及與國內外商品試劑進行比較的結果顯示，該檢測法靈敏度和特異性分別為71.6％，96.7％，Kappa值為0.54，有較好的一致性。
　　第三部分華中地區(qū)不同人群中的HTLV-1/2流行病學調查
　　方法:
　　1.收集2008年

15、-2011年間，河南湖北兩省血清標本5480份，包括獻血人群(3548份)，血液腫瘤患者（908份）和高危人群（1024份）三組。利用北京萬泰的HTLV檢測試劑盒對標本進行初步篩查，陽性標本再進一步通過Western Blot確證HTLV-1或HTLV-2感染情況。
　　2.對感染狀況及高危因素進行單因素方差分析及多元邏輯回歸分析。
　　3.對經Western Blot證實的HTLV-1陽性標本提取前病毒基因組，對全長基因組

16、序列進行分段擴增，與T載體連接后送測序，利用生物學軟件對序列進行拼接;對HTLV-1前病毒基因組序列進行分析，并利用進化樹進行同源性分析。
　　結果:
　　1.ELISA檢出17例HTLV-1/2抗體陽性標本，經過Western Blot證實，HTLV-1抗體陽性7例，HTLV-2抗體陽性3例。
　　2.HTLV-1和HTLV-2間感染率無差異，但高危人群組較獻血源組HTLV-1感染率增加（P=0.03）;HTLV-1

17、與HIV、HBV、HCV合并感染較常見(P＜0.05)。HTLV-1感染流行與HIV及HBV相關（P=0.006，P=0.000）。
　　3.經過測序和拼接獲得HTLV-1全病毒基因組序列(KC807984);該序列長度為9034bp，屬Genotype A，與其他中國病毒株親緣關系最密切，與日本病毒株及加拿大病毒株親緣較近。
　　結論:
　　1.HBZ可以通過其bZIP結構域，與轉錄因子CREB相互作用，影響CREB

18、與cyclinD1啟動子區(qū)域的CRE位點結合，進而抑制下游基因的轉錄，導致293T細胞中cyclin D1表達水平降低，為HBZ在細胞周期變化中的作用機制研究提供理論依據(jù)。
　　2.初步建立了以HBZ為抗原的HTLV-1 ELISA檢測方法。
　　3.流行病學調查發(fā)現(xiàn)華中地區(qū)不同人群中存在HTLV-1/2感染病例，無償獻血人群及血液腫瘤患者中感染率低，高危人群組中HTLV-1/2感染率相對較高，HIV和HBV感染是HTLV-