14-3-3ε和αN-catenin組織特異性表達(dá)及二者之間相互作用的研究.pdf

1、目的：14-3-3蛋白是一類在真核生物中廣泛表達(dá)，氨基酸序列高度保守的蛋白家族。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該類蛋白質(zhì)可以與眾多的原癌基因產(chǎn)物和信號(hào)分子以及細(xì)胞骨架蛋白相結(jié)合，從而在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)調(diào)控等方面起重要的作用。 連環(huán)蛋白(catenin)是一類起細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的細(xì)胞內(nèi)糖蛋白家族。我室以往應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)14-3-3<,ε>與αN-catenin有較強(qiáng)的相互作用。本研究在確定這兩種蛋白

2、組織分布的基礎(chǔ)上，用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)GST-14-3-3<,ε>融合蛋白，經(jīng)GST 蛋白沉降技術(shù)(GSTpull-down assay)，進(jìn)一步驗(yàn)證14-3-3<,ε>與αN-catenin之間的相互作用，為探討14-3-3<,ε>和aN-catenin表達(dá)及其相互作用在血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)表型轉(zhuǎn)化和細(xì)胞骨架重構(gòu)中的意義奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、14-3-3<,

3、ε>和αN-catenin在大鼠不同組織中的表達(dá)活性1．1 14-3-3<,ε>和αN-catenin mRNA檢測(cè)用Trizol一步法提取大鼠血管、腦、肺、心、肝、腎、睪丸、腸、脾共9種組織的總RaNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，測(cè)定OD260吸收確定其含量后，進(jìn)行RT-PCR。 1．2 14-3-3<,ε>和αN-catenin蛋白水平分析提取大鼠血管、腦、肺、心、肝、腎、睪丸、腸、脾共9種組織的總蛋白后進(jìn)行Western b

4、lot分析。 2、14-3-3<,ε>原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定將經(jīng)RT-PCR獲取的14-3-3<,ε>全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切后，定向克隆到pGEX-4T-1載體中，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確無(wú)誤后，命名為pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>。 3、GST-14-3-3<,ε>融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ecoli BL21工程菌，對(duì)IPTG濃度

5、、誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。在最佳條件下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化菌表達(dá)外源蛋白后，收集菌體，超聲裂菌后收集上清，用GST-Sepharose 4B親和層析對(duì)GST-14-3-3<,ε>融合蛋白進(jìn)行純化。 4、GST pull-down研究14-3-3<,ε>和αN-catenin之間的相互作用將大鼠血管蛋白提取液與結(jié)合有GST-14-3-3<,ε>融合蛋白的GST-Sepharose 4B球珠共同孵育后，取沉淀進(jìn)行SDS-PAGE及Western

6、 blot分析。 結(jié)果： 1、14-3-3<,ε>和αN-catenin基因在大鼠不同組織中的表達(dá)活性RT-PCR 結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平上，14-3-3<,ε>在所檢測(cè)的9種組織中都有表達(dá)，且在血管、肺、腎、睪丸、腸中表達(dá)量較高。αN-catenin在各組織中的表達(dá)豐度明顯低于14-3-3<,ε>，且在腎臟中不可檢出。二者在血管均有較高表達(dá)。 Western blot分析結(jié)果顯示，蛋白水平上，在所檢測(cè)的組織中均有14-3

7、-3<,ε>的表達(dá)，αN-catenin在血管、腦、睪丸、腸、脾中表達(dá)較高。 2、pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>中插入的14-3-3<,ε> cDNA長(zhǎng)度正確，核苷酸序列無(wú)誤。 3、GST-14-3-3<,ε>融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)化pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>的宿主菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可表達(dá)分子量為54 kD的

8、蛋白質(zhì)，與預(yù)期大小一致。 4、GST-14-3-3<,ε>融合蛋白的分離純化轉(zhuǎn)化菌裂解液經(jīng)GST-Sepharose 4B親和層析純化后，SDS-PAGE可見(jiàn)分子量為54 kD的單一條帶。 5、14-3-3<,ε>與αN-catenin之間存在物理學(xué)上的相互作用GST pull-down分析結(jié)果顯示，aN-catenin可與GST-14-3-3<,ε>蛋白結(jié)合，但不能與GST蛋白相結(jié)合。表明14-3-3<,ε>與αN-c

9、atenin可直接進(jìn)行相互作用。 結(jié)論： 1、確立了14-3-3<,ε>和αN-catenin基因在大鼠不同組織中的表達(dá)活性。 2、成功構(gòu)建了14-3-3<,ε>原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-14-3-3<,ε>。 3、對(duì)GST-14-3-3<,ε>融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。 4、經(jīng)過(guò)對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行GST親和層析得到電泳純的GST-14-3-3<,ε>融合蛋白。 5、