家蠅14-3-3ζ基因的表達(dá)及抗菌功能初探.pdf

1、目的：
　　從家蠅cDNA文庫(kù)中篩選獲得家蠅14-3-3δ（MD14-3-3δ）基因序列，對(duì)該序列及其編碼蛋白進(jìn)行分子特性分析，原核表達(dá)，初步探討重組蛋白的抗菌活性及抗菌機(jī)制；檢測(cè)MD14-3-3δ基因在家蠅生活史中各齡期及3齡幼蟲不同組織部位時(shí)空表達(dá)模式，初步探討經(jīng)大腸埃希菌誘導(dǎo)后，基因表達(dá)譜的變化，為進(jìn)一步探討其功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、序列分析：采用生物信息學(xué)相關(guān)軟件，對(duì)家蠅14-3-3δ基因及其編

2、碼蛋白的基本理化性質(zhì)、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能。2、cDNA克隆及原核表達(dá)：根據(jù)MD14-3-3δ的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，構(gòu)建pET-28a(+)-MD14-3-3δ重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物的可溶性，通過鎳柱純化重組蛋白。3、Western blot及質(zhì)譜鑒定：將純化的MD14-3-3δ蛋白免疫新西蘭大白兔，獲取多克隆抗體，Western b

3、lot鑒定重組蛋白；切下純化蛋白的SDS-PAGE條帶，送公司進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。4、重組MD14-3-3δ蛋白的抗菌活性檢測(cè)及抗菌功能初探：采用微量液體稀釋法，以大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，檢測(cè)重組蛋白的抗菌活性；細(xì)胞內(nèi)膜滲透性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MD14-3-3δ對(duì)大腸埃希菌細(xì)胞膜通透性的影響。5、MD14-3-3δ基因時(shí)空表達(dá)模式的研究：1）收集家蠅生活史各發(fā)育階段（卵、各齡期、蛹、成蟲）的蟲體及3齡幼蟲不同組織（體壁、脂肪體、馬氏管、

4、中腸、唾液腺、氣管），分別提取總RNA后并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以家蠅RPS18為內(nèi)參基因，對(duì)不同樣本的MD14-3-3δ基因表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)，所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。2）大腸埃希菌誘導(dǎo)后MD14-3-3δ基因時(shí)空表達(dá)譜的變化：采用顯微注射的方法將細(xì)菌注入家蠅2齡晚期幼蟲，分別收集誘導(dǎo)后3h、6h、12h、24h、36h、48h蟲體，qPCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)MD14-3-3δ基因表達(dá)水平的

5、變化，以注射PBS組為對(duì)照。
　　結(jié)果：
　　1、MD14-3-3δ基因ORF全長(zhǎng)771 bp，編碼257個(gè)氨基酸，理論分子量29.35 kD；等電點(diǎn)4.87，屬于親水性的酸性蛋白，含有多種酶的結(jié)合位點(diǎn)，有14-3-3家族結(jié)構(gòu)域和活性位點(diǎn)，定位于細(xì)胞核中，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。2、成功構(gòu)建MD14-3-3δ原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)后，上清可溶表達(dá)重組蛋白，經(jīng)鎳柱純化，獲得純化的MD14-3-3δ重組蛋白。3、W

6、estern blot結(jié)果顯示，得到與預(yù)計(jì)條帶大小相符的清晰條帶；質(zhì)譜分析顯示，重組蛋白序列與MD14-3-3δ序列一致。4、體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果：MD14-3-3δ蛋白對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用，MIC(minimal inhibitory concentration)值分別為0.16 mg/mL、0.25 mg/mL。細(xì)胞內(nèi)膜滲透性實(shí)驗(yàn)顯示，隨著MD14-3-3δ作用時(shí)間的延長(zhǎng)，A430nm值從0.1左右上升至0.7，隨著

7、時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。5、時(shí)空表達(dá)模式研究：1）在不同發(fā)育時(shí)期，以卵期為參照，該基因在成蟲中表達(dá)量最高，表達(dá)量為成蟲>2齡幼蟲>蛹>1齡幼蟲>3齡幼蟲>卵，成蟲比卵期上調(diào)了141.773倍(P<0.05），2齡幼蟲則上調(diào)了79.7967倍(P<0.05)；在3齡幼蟲不同組織中，該基因在體壁表達(dá)量最高，其次為氣管（P<0.05）和唾液腺（P<0.01）。2）注射感染大腸埃希菌后,以PBS組為對(duì)照進(jìn)行計(jì)算，表明注射感染大腸埃希菌后3 h，MD1

8、4-3-3δ基因出現(xiàn)明顯的上調(diào)，上調(diào)了14.704倍(P<0.05），其次為24 h，上調(diào)了2.503倍。36 h、48 h為下調(diào)趨勢(shì)(P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、本研究對(duì)家蠅14-3-3δ基因進(jìn)行了分子特性分析，體外克隆、表達(dá)，獲得并鑒定了MD14-3-3δ重組蛋白；該重組蛋白在體外對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌均有抗菌效果，對(duì)大腸埃希菌抗菌活性較好；并能改變其細(xì)胞內(nèi)膜的通透性。2、MD14-3-3δ基因在家蠅不同