14-3-3蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及作用研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在成人其發(fā)生率約占顱內(nèi)腫瘤的一半。該類腫瘤患者中的大部分即使手術(shù)后接受放療、化療等綜合治療，療效依然欠佳。其中，惡性程度最高的多形性膠質(zhì)母細胞瘤患者經(jīng)綜合治療后，其中位數(shù)生存期也僅為1年。在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中有多種基因的連鎖改變，這些改變最終使腫瘤細胞獲得無限增值的生長優(yōu)勢，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤細胞獲得對抗細胞調(diào)亡的能力是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，發(fā)現(xiàn)和闡明瘤細胞逃避細胞調(diào)亡的機制有助于研

2、究腫瘤治療的新方法。 14-3-3蛋白是一類高度保守的小分子多功能酸性二聚體蛋白。它們是在1967年一項有關(guān)腦蛋白的研究中被發(fā)現(xiàn)，并根據(jù)其在隨后的蛋白電泳中的位置而命名的。最初只發(fā)現(xiàn)這類蛋白在神經(jīng)元中有大量的表達，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)它們存在于所有真核生物體中。目前，已發(fā)現(xiàn)這類蛋白在哺乳類有機體中有由不同基因編碼的7個亞型及200多個能與其相互結(jié)合的配體分子。研究還發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白在多種細胞生理過程中起重要作用。近年的研究還提示

3、，14-3-3有可能通過抑制細胞調(diào)亡而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前，國內(nèi)外尚無14-3-3在膠質(zhì)瘤中表達情況及作用的研究。基于此，本課題從以下三個方面進行了探討。 114-3-3蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義：采用免疫組化ABC法檢測了10例正常腦組織、5個膠質(zhì)瘤細胞系(U251、U87、BT325、SHG-44和C6)及118例人腦膠質(zhì)瘤石蠟標本中14-3-3蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，14-3-3蛋白主要表達于正常腦組織中的神經(jīng)

4、元胞體和突起，在幾類神經(jīng)元中有強表達。而絕大部分膠質(zhì)細胞中無14-3-3蛋白的表達，僅在極少量的膠質(zhì)細胞中可見其弱陽性表達。5株人腦膠質(zhì)瘤細胞系均可見14-3-3蛋白強陽性表達。絕大部分星形細胞瘤標本中可見14-3-3蛋白的陽性表達，其表達情況為：Ⅰ級78.6％(11/14)，Ⅱ級76.5％(13/17)，Ⅲ級76.2％(16/21)，Ⅳ級79.3％(23/29)。在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級3個不同惡性級別的星形細胞腫瘤中，14-3-3蛋白的陽性表

5、達率無顯著差別(P=-0.958)，但14-3-3蛋白的表達強度(SI)和范圍(PP)有隨腫瘤的惡性度增高而增加的趨勢(P=-0.044)。大部分其它類型的膠質(zhì)瘤中也可見14-3-3蛋白的陽性表達，其表達情況為：少突膠質(zhì)細胞瘤66.7％(4/6)，間變型少突膠質(zhì)細胞瘤100％(4/4)，室管膜瘤50％(2/4)，間變型室管膜瘤66.7％(2/3)，脈絡叢乳頭狀瘤100％(5/5)，松果體瘤100％(3/3)，和髓母細胞瘤66.7％(8/

6、12)。結(jié)果提示14-3-3蛋白在人腦膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)瘤細胞系中有大量的表達，其上調(diào)表達與彌漫侵潤性星形細胞瘤的惡性程度相關(guān)。14-3-3蛋白表達上調(diào)可能是大多數(shù)膠質(zhì)瘤瘤細胞逃避細胞凋亡的有效方式，因此，14-3-3蛋白有望成為膠質(zhì)瘤基因治療的一個新靶點。 2Difopein抑制14-3-3蛋白和其配體分子的結(jié)合對人腦膠質(zhì)瘤細胞體外增殖以及凋亡的影響：采用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染方法將含特異性14-3-3蛋白拮抗劑Difopein(di

7、mericfourteen-three-threepeptideinhibitor)的質(zhì)粒pSCM138(difopein/pEYFP-C1)和對照質(zhì)粒pEYFP-C1(不含Difopein)轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞。通過免疫共沉淀、Westernblot、激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡、DNALadder、TUNEL染色、流式細胞術(shù)(FCM)以及Caspase-3檢測定性和定量研究了Difopein抑制14-3-3蛋白和其配體分

8、子的結(jié)合對U251體外細胞凋亡的影響。并通過FCM對Difopein和順鉑(Cisplatin)協(xié)同作用于U251細胞的效果進行了檢測。免疫共沉淀檢測證實difopein能與U251膠質(zhì)瘤細胞中的14-3-3蛋白結(jié)合形成復合物。激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡、DNALadder和TUNEL染色顯示，與U251、轉(zhuǎn)染pEYFP-C1的U251細胞相比，轉(zhuǎn)染pSCM138的U251細胞中凋亡細胞明顯增多。FCM測定細胞周期顯示，與U251、轉(zhuǎn)染

9、pEYFP-C1的U251細胞相比，轉(zhuǎn)染pSCM138的U251細胞G1期細胞明顯增多，S期和G2期細胞明顯減少。FCM定量分析凋亡細胞顯示，與U251(1.0％)、轉(zhuǎn)染pEYFP-C1的U251(2.0％)細胞相比，轉(zhuǎn)染pSCM138的U251細胞凋亡細胞增加約6～11倍(24h達12.0％,48h達21.5％)。Caspase-3檢測也顯示，與U251、轉(zhuǎn)染pEYFP-C1的U251細胞相比，轉(zhuǎn)染pSCM138的U251細胞中Cas

10、pase-3的活性明顯增加(P＜0.01)。FCM檢測Difopein和順鉑協(xié)同作用的效果證實，Difopein能顯著的增加U251細胞對順鉑的敏感性。上述研究結(jié)果提示：①difopein能與U251細胞中的14-3-3蛋白結(jié)合來抑制14-3-3與其它蛋白之間相互作用，從而促進U251瘤細胞凋亡，且difopein誘導U251細胞凋亡的過程不依賴p53基因的參與；②difopein能通過阻斷14-3-3與其它蛋白之間相互作用而增強U25

11、1細胞對順鉑的敏感性；③以14-3-3蛋白為靶點來設計新的腦膠質(zhì)瘤治療方法是可行的。 3Difopein抑制14-3-3蛋白和其配體分子的結(jié)合對人腦膠質(zhì)瘤細胞裸鼠成瘤性的影響：通過PCR從pSCM138(difopein/pEYFP-C1)質(zhì)粒中獲得了全序列EYFP和EYFP-Difopein基因，將用BamHⅠ和BglⅡ雙酶切的EYFP和EYFP-difopein片段插入到用BamHⅠ酶切后的pGfa2-LacZ載體，隨后將得

12、到的重組質(zhì)粒用BglⅡ酶切后回收的大片段插入到用BamHⅠ和ClaⅠ雙酶切后的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX，從而成功地構(gòu)建了Gfa2啟動子控制下表達EYFP和EYFP-Difopein基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-Gfa2-EYFP和pLNCX-Gfa2-EYFP-difopein。結(jié)果顯示，pLNCX-Gfa2-EYFP-difopein和pLNCX-Gfa2-EYFP能在表達GFAP蛋白的U251細胞中特異性地表達EYFP-difop

13、ein和EYFP基因mRNA及蛋白，而在不表達GFAP的NIH-3T3中EYFP-difopein或EYFP基因mRNA及蛋白均無表達。這說明我們所構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，gfa2啟動子的確能控制目的基因在星形膠質(zhì)細胞來源的膠質(zhì)瘤中的特異性表達。我們構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-Gfa2-EYFP-difopein和pLNCX-Gfa2-EYFP在基因靶向治療中具有雙重保險作用：第一在感染水平上，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只感染分裂的細胞而不感染

14、未分裂的細胞，與未分裂的正常細胞相比腫瘤細胞具有更加旺盛的分裂能力，因此逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能有效地感染處于細胞增殖周期的腫瘤細胞但不影響處于增殖周期外的靜止細胞；第二在轉(zhuǎn)錄水平上，gfa2啟動子能特異性地啟動目的基因(EYFP-difopein基因或EYFP基因)在星形膠質(zhì)細胞來源腫瘤細胞中的表達而在其它不含GFAP的細胞中不表達，這樣就保證了在不影響14-3-3蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)其它類型細胞中的正常生理功能的同時又能有效地阻斷在星形膠質(zhì)細

15、胞來源腫瘤細胞中14-3-3蛋白與其配體蛋白的結(jié)合。這為我們進一步的裸鼠腫瘤試驗奠定了基礎。 在裸鼠成瘤試驗中，我們將U251+GP/EYFP-difopein(轉(zhuǎn)染pLNCX-Gfa2-EYFP-difopein的GP+E-86包裝細胞)細胞(A組)、U251+GP/EYFP(轉(zhuǎn)染pLNCX-Gfa2-EYFP的GP+E-86包裝細胞)細胞(B組)和U251細胞(C組)分別接種于裸鼠背部皮下，建立人腦膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植瘤模型。

16、定期觀察腫瘤生長情況，測定腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察6周后處死動物，稱瘤重。結(jié)果顯示，與B組和C組裸鼠相比，A組裸鼠腫瘤形成時間延遲，腫瘤生長緩慢，腫瘤體積及瘤重均明顯減小(P均＜0.01)。免疫組化染色顯示各組腫瘤組織符合多形性膠質(zhì)母細胞瘤的形態(tài)。Westernblot檢測顯示，與B組和C組相比，A組裸鼠腫瘤組織中活性的Capase-3蛋白明顯上調(diào)。上述結(jié)果提示在裸鼠腫瘤細胞中difopein可通過抑制14-3-3蛋白和其配體分