不同抗旱性青稞LEA2-LEA3蛋白基因的克隆與表達.pdf

1、作物的抗旱性是一個多基因控制的、極為復(fù)雜的數(shù)量性狀，植物對干旱在分子水平上的差異反應(yīng)通過植物組織生理和細胞生物學(xué)水平，最終表現(xiàn)為植物抗旱性的不同。在我國，旱地農(nóng)業(yè)超過耕地面積的50％，但水資源短缺，因此培育和選育抗旱高產(chǎn)作物是發(fā)展節(jié)水型農(nóng)業(yè)最有效的途徑。
　　 青藏高原氣候惡劣、年均降雨量少，也是世界大麥初生起源中心，因而蘊藏了十分豐富的與抗逆相關(guān)的種質(zhì)資源材料，從這些特殊的資源材料克隆抗旱基因，不僅對培育抗旱、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)大麥新

2、品種具有重要理論意義和經(jīng)濟價值，而且對整個作物抗旱基礎(chǔ)和育種應(yīng)用研究都具重大促進作用。
　　 為了篩選青稞(裸大麥，Hordeum vulgare ssp.vulgare)抗旱性材料，本研究選用來自青藏高原不同地區(qū)的84份青稞為材料，在葉片失水率(water loss rate，WLR)檢測分析的基礎(chǔ)上，選擇失水率值差異顯著的12個品種，通過相對含水量(relative water content，RWC)和反復(fù)干旱法評價其抗旱

3、性，并通過植株對干旱脅迫下的丙二醛(MDA)含量和游離脯氨酸(free-proline)含量變化，了解不同抗旱性材料的生理反應(yīng)特性。選擇抗旱性強弱不同的品種各兩份進行LEA2蛋白基因(Dhn6基因)、LEA3蛋白基因(HVA1基因)的克隆，比較LEA蛋白結(jié)構(gòu)差異與作物抗旱性之間的關(guān)系。同時，對抗旱性不同的青稞品種受到干旱時間不同的失水變化率(dynamics water loss rate，DWLR)進行了檢測；對抗旱性不同的青稞對照材

4、料進行2 h、4 h、8 h和12 h的快速干旱處理，通過SYBR Green實時熒光定量RT-PCR技術(shù)對Dhn6基因、Dhn11基因、Dhn13基因和HVA1基因在不同抗旱性材料受到不同干旱時間處理后的相對表達水平進行了檢測。本研究對LEA蛋白基因在抗旱性不同的青稞材料中的干旱脅迫分子水平上的差異反應(yīng)進行了研究，也對植物的抗旱機理進行了初步探討。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.青稞苗期進行離體葉片失水率測定結(jié)果表明，來自青藏高

5、原的84份青稞材料的WLR在0.086～0.205gh-1g-1DW之間。選擇WLR低于0.1gh-1g-1DW和WLR高于0.18gh-1g-1DW的品種各6份，并對苗期分別進行未干旱及干旱12小時的處理。相對含水量檢測結(jié)果表明，低失水率青稞材料干旱后的具有更高的相對含水量，盆栽缺水試驗也顯示葉片失水率低的材料耐旱能力強于失水率高的材料。通過水合茚三酮法測定離體葉片游離脯氨酸的含量，結(jié)果表明，所有品種未干旱處理時，游離脯氨酸含量差異不

6、大(17.10～25.74μgg-1FW)；干旱12小時后，低失水率的品種游離脯氨酸含量明顯增高(32.99～53.45μgg-1FW)，高失水率品種的游離脯氨酸含量與干旱前變化不明顯(P＜0.05)。硫代巴比妥酸法測定離體葉片丙二醛(MDA)含量，結(jié)果顯示，12份所選對照品種中，丙二醛的含量在0.97～2.74nmolg-1FW，干旱12小時后丙二醛的含量顯著上升(1.46～4.74nmolg-1FW)，高失水率的6個品種的丙二醛含量

7、在未干旱和干旱處理時都明顯高于低WLR品種。本研究結(jié)果表明青稞的低失水率、低丙二醛含量、高相對含水量和高脯氨酸含量具相關(guān)性(P＜0.05)。綜上研究，我們認為作物失水率的測定可以作為快速檢測作物抗旱性的指標之一，因此，強抗旱品種喜瑪拉10號(TR1)、品比14號(TR2)和弱抗旱品種冬青8號(TS1)、QB24(TS2)被選作抗旱基因克隆和表達分析的研究材料。
　　 2.高等植物胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogen

8、esis abundant proteins，LEA proteins)與植物耐脫水性密切相關(guān)，為了探討青稞LEA蛋白結(jié)構(gòu)差異性與植物抗旱性的關(guān)系，本研究以強抗旱品種(喜瑪拉10號、品比14號)和弱抗旱品種(冬青8號、QB24)為材料，利用同源克隆法，通過RT-PCR，分別克隆了與抗旱性密切相關(guān)的Dhn6基因和HVA1基因。Dhn6基因序列分析結(jié)果表明，強抗旱品種品比14號和弱抗旱品種冬青8號Dhn6基因所克隆到的序列為1026bp，它

9、們之間只有5個堿基的差異；喜瑪拉10號和QB24克隆到的序列長963bp。在強弱不同的抗旱品種中有22個核苷酸易突變位點，相應(yīng)的脫水素氨基酸序列推導(dǎo)結(jié)果表明，22個核苷酸突變位點中，僅有8個位點導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸殘基的改變，其余的位點系同義突變，另外，21個富含甘氨酸序列的缺失并沒有聯(lián)系作物抗旱性特征。推測這些同義突變位點的氨基酸殘基對維持青稞DHN6蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能起著非常重要的作用，也可能DHN6蛋白對青稞長期適應(yīng)逆境脅迫和遺傳進

10、化的結(jié)果。對HVA1基因的序列分析結(jié)果表明，冬青8號、QB24、品比14號和喜瑪拉10號的目的基因核苷酸序列全長分別為661bp、697bp、694bp和691bp，它們都包含1個完整的開放閱讀框。相應(yīng)的LEA3蛋白氨基酸序列結(jié)果表明，11個高度保守的氨基酸殘基組成基元重復(fù)序列的拷貝數(shù)與青稞抗旱性之間沒有必然關(guān)系，在強抗旱品種(喜瑪拉10號、品比14號)中三個共同的氨基酸突變位點Gln32、Arg33和Ala195可能對抗旱蛋白的結(jié)構(gòu)和

11、功能有影響；另外，強抗旱青稞品種LEA3蛋白質(zhì)中11-氨基酸保守基元序列拷貝數(shù)和極性氨基酸占蛋白的比例更高，推測LEA3蛋白中基元序列拷貝數(shù)和極性氨基酸占蛋白的比例對該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能影響更大。
　　 3.LEA蛋白基因的表達水平的上調(diào)與植物的耐脫水性密切相關(guān)，我們對強抗旱性材料(喜瑪拉10號、品比14號)和弱抗旱材料(冬青8號、QB24)進行干旱處理2 h、4 h、6 h、8 h和10 h的失水變化率進行測定，結(jié)果表明弱抗旱品

12、種在2～4小時之間失水率變化最明顯，而四個對照品種的失水率在8小時后和24小時的失水率值變化不大。進一步提取青稞苗期進行2 h、4 h、8 h和12 h的干旱處理后的總RNA，通過SYBR Green實時熒光定量RT-PCR技術(shù)對青稞脫水素基因(Dhn6、Dhn11和Dhn13)和LEA3蛋白基因(HVA1)的相對表達水平受干旱時間和作物抗旱性的影響進行了檢測。研究發(fā)現(xiàn)，抗旱性不同的青稞品種隨干旱處理的時間延長，Dhn6、Dhn11、D

13、hn13和HVA1基因的相對表達水平不同。Dhn6基因的相對表達水平在強抗旱青稞品種干旱8小時后快速上升，但在弱抗旱青稞品種干旱處理12小時后檢測到更高表達量；Dhn11基因在對照青稞抗旱品種的表達累積水平隨干旱時間的延長持續(xù)下降；整個干旱過程中，Dhn13基因的相對表達水平在弱抗旱品種持續(xù)上升，在強抗旱品種中干旱處理8小時快速上升并達到最高，干旱12小時后降低。與脫水素基因相比較，強抗旱青稞品種在干旱2小時后HVA1基因的相對表達水平

14、顯著升高，相對表達量隨干旱處理的時間持續(xù)上升，在干旱12小時后達到最高；與之相比較，在整個干旱過程中，弱抗旱品種的相對表達水平顯著低于強抗旱品種，在干旱8小時之前弱抗旱品種的相對表達水平變化不明顯；在干旱8～12小時后卻顯著上升。上述結(jié)果表明，不同的LEA蛋白在植物耐脫水過程中的干旱表達累積水平不同；干旱不是誘導(dǎo)高等植物Dhn11基因表達的主要因素；植物的抗旱性不同，不同LEA蛋白基因?qū)Ω珊档姆磻?yīng)有差異。推測某些LEA蛋白基因的干旱脅迫

15、早期表達累積程度與植物的抗旱性直接相關(guān)；其中，Dhn11基因和Dhn12基因不同的表達模式可能與干旱調(diào)控表達順式作用成分(dehydrationresponsive element，DRE)的有無或結(jié)構(gòu)上的差異有關(guān)。
　　 本研究結(jié)果認為，(1)失水率和相對含水量可作為植物抗旱性檢測的指標之一；(2)DHN6同義突變位點的氨基酸殘基對維持該蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用；(3)11-氨基酸保守基元序列拷貝數(shù)和極性氨基酸的比例對