青稞C4H基因的克隆與組織表達(dá)分析.pdf

1、青稞(Hordeum vulgareL.var.nudum Hook.f)即裸大麥，是營養(yǎng)豐富的糧食作物，不僅富含蛋白質(zhì)和膳食纖維，更含有黃酮類化合物、γ-氨基丁酸等活性功能成分，其保健和醫(yī)療作用一直是大麥工作者研究的重點(diǎn)。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌抗腫瘤、延緩衰老、保護(hù)心腦血管等多種藥理功能，是人們理想的保健物質(zhì)，植物中的天然黃酮類化合物主要有黃酮、黃酮醇、黃烷酮、異黃酮等十幾類，大麥中的黃酮類物質(zhì)以黃酮醇為主。苯丙烷代謝途徑是植物

2、最重要的次生代謝途徑之一，其公共苯丙氨酸途徑下游的黃酮支路是植物黃酮合成的重要方式。
　　肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)是苯丙氨酸途徑第二步的關(guān)鍵酶，也被認(rèn)為是該途徑的限速酶，它作為細(xì)胞色素P450酶蛋白家族參與苯丙烷代謝途徑的第一個(gè)成員，高效地催化苯丙烷代謝途徑中的第一個(gè)氧化反應(yīng):在O2和NADPH存在下將反式肉桂酸苯環(huán)的C4位羥基化生成對(duì)-香豆酸。為從分子水平了解青稞黃酮代謝途徑相

3、關(guān)基因的作用，使用RT-PCR結(jié)合同源克隆與RACE技術(shù)，用青稞材料“94-19-1”首次克隆出青稞肉桂酸-4-羥化酶(HvC4H)基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其在青稞胚乳發(fā)育5個(gè)時(shí)期里不同組織（子粒、莖部和葉片）中的表達(dá)水平進(jìn)行了相對(duì)定量分析。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫里已知的禾本科單子葉植物C4H基因序列，通過序列比對(duì)在保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，同源克隆得到HvC4H基因的保守

4、片段。在保守片段的基礎(chǔ)上，采用RACE技術(shù)分別擴(kuò)增出HvC4H基因的3'端和5'端序列并由序列拼接得到cDNA全長(zhǎng)。結(jié)果表明，青稞肉桂酸-4-羥化酶基因的cDNA長(zhǎng)為1951 bp，開放閱讀框(ORF)為1518bp(125-1642)，共編碼505個(gè)氨基酸;5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)為124bp，3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)為309bp并包含了27bp的Poly-A尾。
　　2.Blast序列比對(duì)結(jié)果顯示，HvC4H基因與

5、二穗短柄草C4H基因相似度最高，為94％，與綠竹筍、柳枝稷、慈竹、粟米等C4H基因的相似度在92％，與水稻、玉米、垂尾桉、高粱等C4H基因的相似度在82％以上。HvC4H氨基酸序列包含了其CYP450酶蛋白家族已知的保守域和特征基序，包括血紅素結(jié)合域、5個(gè)特征性底物識(shí)別基序、脯氨酸鉸鏈基序等，同時(shí)也識(shí)別到C4H區(qū)別于其它CYP450蛋白的特有的氨基酸活性位點(diǎn)。
　　3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以在大麥胚乳發(fā)育期表達(dá)穩(wěn)定的β-a

6、ctin和α-tubulin基因?yàn)閮?nèi)參，檢測(cè)了HvC4H基因在青稞胚乳發(fā)育5個(gè)時(shí)期里子粒、莖部和葉片中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HvC4H基因在青稞胚乳發(fā)育各個(gè)時(shí)期的子粒、莖部和葉片中的表達(dá)存在明顯的組織和時(shí)空差異性。莖部中的表達(dá)量剛開始最高，4天后急劇降低;葉片中的表達(dá)量在第8天達(dá)到最高;子粒中的表達(dá)量不高，但每個(gè)時(shí)期的差距較小?？偟目磥?，在整個(gè)胚乳發(fā)育期，莖中HvC4H基因的表達(dá)量相對(duì)較高，而子粒中HvC4H基因的表達(dá)較低但保持穩(wěn)定水平