青稞B組醇溶蛋白基因與上游調(diào)控區(qū)的克隆及基因表達(dá).pdf

1、高等植物種子胚乳貯藏蛋白是種子發(fā)芽時(shí)的主要氮源，也是人類和動(dòng)物食用植物蛋白的主要來源。大麥種子胚乳貯藏蛋白主要是醇溶蛋白(hordeins)，占大麥胚乳總蛋白的50-60％。根據(jù)大麥醇溶蛋白的大小和組成特點(diǎn)，大麥醇溶蛋白被劃分為三種類型：富硫蛋白亞類(B，γ-hordeins)、貧硫蛋白亞類(C-hordeins)以及高分子量蛋白亞類(D-hordeins)。B組和C組醇溶蛋白是大麥胚乳的兩類主要貯藏蛋白，它們分別占大麥總醇溶蛋白成分的

2、70-80％和10-12％。遺傳分析表明，大麥B、C、D和γ-組醇溶蛋白分別是由位于大麥第五染色體1H(5)上的Hor2、Hor1、Hor3和Hor5位點(diǎn)編碼。Hor2位點(diǎn)編碼大量分子量相同但組成不同的B組醇溶蛋白(B-hordein)。B-hordein的種類、數(shù)量和分布是影響大麥釀造、食用及飼養(yǎng)品質(zhì)的重要因素之一。為深入了解B-hordein基因家族的結(jié)構(gòu)和染色體組織，探明Hor2位點(diǎn)基因表達(dá)的發(fā)育調(diào)控機(jī)制，最終達(dá)到改良禾谷類作物籽

3、粒品質(zhì)的目的，本研究以青藏高原青稞為材料，采用同源克隆法，分別克隆B-hordein基因和啟動(dòng)子，通過原核生物表達(dá)驗(yàn)證B-hordein基因功能，并利用實(shí)時(shí)定量PCR探索B-hordein基因表達(dá)時(shí)空關(guān)系，取得如下研究結(jié)果：
　　 1.以具有特殊B組醇溶蛋白亞基組成的9份青藏高原青稞為材料，根據(jù)GenBank中三個(gè)B-hordein基因序列(GenBank No.X03103，X53690和X53691)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過PCR

4、擴(kuò)增，獲得23個(gè)B-hordein基因克隆并對(duì)其進(jìn)行了序列分析。核苷酸序列分析表明，所有克隆均包含完整的開放閱讀框。有11個(gè)克隆都存在一個(gè)框內(nèi)終止密碼子，推測(cè)這11個(gè)克隆可能是假基因。推測(cè)的氨基酸序列分析表明，所有大麥B-hordein具有相似的蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)，均包括一個(gè)高度保守的信號(hào)肽、中間重復(fù)區(qū)以及C-端結(jié)構(gòu)域。不同大麥種重復(fù)區(qū)內(nèi)重復(fù)基元的數(shù)目有較大差異。青稞材料Z07-2和Z26的B-hordeins僅具有12個(gè)重復(fù)基元結(jié)構(gòu)，更接

5、近于野生大麥。這些重復(fù)基元數(shù)目的差異導(dǎo)致了重復(fù)區(qū)序列長度和結(jié)構(gòu)的變異。這種現(xiàn)象極可能是由于醇溶谷蛋白基因在進(jìn)化過程中染色體的不平衡交換或復(fù)制滑動(dòng)所造成的。對(duì)所克隆基因和禾本科代表性醇溶谷蛋白基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明所有來自栽培大麥的B-hordeins聚類成一個(gè)亞家族，來自野生大麥的B-hordeins以及普通小麥的LMW-GS聚類成另外一個(gè)亞家族，表明這兩個(gè)亞家族的成員存在顯著差異。此外，我們發(fā)現(xiàn)B-hordein基因推測(cè)的C-末端

6、序列具有一些有規(guī)律的特征：即具有相同C-末端序列的B-hordein基因在系統(tǒng)發(fā)生樹中聚類為同一個(gè)亞組(除BXQ053，BZ09-1，BZ26-5分別單獨(dú)聚為一類外)。這個(gè)特征將有助于我們對(duì)所有B組醇溶蛋白基因家族成員進(jìn)行分類，避免了在SDS-PAGE電泳圖譜上僅依靠大小分類的局限性。
　　 2.根據(jù)上述克隆的青稞B-hordein基因的5'端序列設(shè)計(jì)三條基因特異的反向引物，以青稞Z09和Z26的基因組DNA為模板，采用SON-

7、PCR和TAIL-PCR技術(shù)分離克隆出8個(gè)B-hordein基因的上游調(diào)控序列(命名為Z09P和Z26P)。序列分析表明，推測(cè)的TATA box位于-80 bp，CAAT-like box位于-140 bp處。此外，Z09P和Z26P中有六個(gè)序列在-300 bp處均存在一個(gè)由高度保守的EM基序和類GCN4基序構(gòu)成的胚乳盒(Endosperm Box，EB)，在約-560 bp處存在一個(gè)胚乳盒類似結(jié)構(gòu)。而Z09P-2和Z26P-3不存在保

8、守的胚乳盒或其類似結(jié)構(gòu)，預(yù)示著這兩個(gè)啟動(dòng)子所調(diào)控的基因表達(dá)可能受不同類型反式作用因子的調(diào)節(jié)，推測(cè)該啟動(dòng)子對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控具有多樣性。
　　 3.將B-hordein基因的開放閱讀框定向克隆到表達(dá)載體pET-30a中，將其導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中進(jìn)行外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)以驗(yàn)證所克隆基因的功能。結(jié)果表明僅含重組子pET-BZ07-2和pET-BZ26-5的BL21細(xì)菌有目的表達(dá)蛋白產(chǎn)生。在誘導(dǎo)3 h時(shí)的蛋白表達(dá)量最高；3 mM

9、IPTG誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)量要高于1 mM IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)量。這為分離純化B-hordein蛋白以及進(jìn)一步研究其對(duì)大麥籽粒品質(zhì)的影響奠定基礎(chǔ)。
　　 4.根據(jù)從青稞Z09和Z26中分離克隆的B-hordein基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)基因特異的引物，同時(shí)，選擇大麥α-微管蛋白基因(GenBank no.U40042)為看家基因并設(shè)計(jì)特異引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了青稞籽粒4個(gè)胚乳發(fā)育時(shí)間段的B-hordein基因表達(dá)，熒光定量結(jié)果顯

10、示：兩份材料中B-hordein基因的表達(dá)量均隨發(fā)育過程的進(jìn)行而逐漸升高。Z09中B-hordein基因在開花后7天開始轉(zhuǎn)錄，而Z26開花4天后就有低水平B-hordein的表達(dá)，這表明Z26中B-hordein基因可能比Z09表達(dá)的較早或者Z09中B-hordein基因表達(dá)水平較低以致于不能被檢測(cè)到。此外，在4個(gè)不同的胚乳發(fā)育時(shí)期中，Z26中B-hordein基因的表達(dá)量均高于Z09材料。在開花12天到18天的過程中，Z09和Z26中