耐頭孢曲松淋球菌的體外人工誘導及其耐藥機制的研究.pdf

1、背景與目的：淋病是世界各國(包括我國)最常見的性傳播感染性疾病(sexuallytransmittedinfections，STIs)之一，其致病菌為淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae，簡稱淋球菌)。淋球菌的重要特點之一是容易對多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，從而造成治療上的困難。全球的STIs流行病學研究結果表明，淋病發(fā)病率從上個世紀八十年代到九十年代早期有所下降，但自九十年代后期開始其發(fā)病率又有上升趨勢。造成淋病發(fā)病率再

2、次上升的一個重要原因是淋球菌對多種抗菌藥物耐藥性的增加，其中多重耐藥的情況較為突出，并且近年來國內外還發(fā)現(xiàn)淋球菌對頭孢曲松敏感性降低的情況。由于目前美國疾病預防與控制中心(CDC)、世界衛(wèi)生組織(WHO)及我國衛(wèi)生部推薦的治療淋病的一線藥物是第三代頭孢類抗生素頭孢曲松(Ceftriaxone，CRO)，耐頭孢曲松淋球菌的出現(xiàn)及流行將使淋病的治療面臨更嚴峻的挑戰(zhàn)：一旦淋球菌對第三代頭孢類抗生素產(chǎn)生耐藥，目前淋病治療的最后一道防線將被突破，

3、發(fā)病率將急劇增加，治療將十分困難，淋病的流行將更加廣泛。因此，研究淋球菌對頭孢曲松的耐藥機制刻不容緩。由于迄今為止國外尚未分離出耐CRO的淋球菌，故對其耐藥機制的研究開展得不多，因此，我們擬采用人工誘導的方法在實驗室誘導出耐CRO的淋球菌，用抑制性削減雜交技術(suppressionSubtractivehybridization，SSH)尋找淋球菌對CRO耐藥的相關基因，前瞻性地研究淋球菌耐第三代頭孢類抗生素的機制，為制定出防止或延緩

4、耐CRO淋球菌產(chǎn)生的措施提供理論依據(jù)。本研究的結果對我國乃至全球淋病的預防和治療將有十分重大的意義。 方法：1.用次抑菌濃度生長誘導法將對CR0敏感的淋球菌臨床分離株(編號2003-5-12，簡稱臨床株)和國際標準株(ATCC49226)誘導成耐CRO菌株。并用紙片法測定誘導前后淋球菌對青霉素、四環(huán)素、紅霉素及環(huán)丙沙星敏感性，觀察耐CRO誘導前后淋球菌對其它抗菌藥物的敏感性的變化。 2.采用透射電鏡觀察誘導前后淋球菌菌體

5、結構的變化。 3.用SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳對CRO耐藥誘導前后淋球菌的膜蛋白進行電泳分析，了解誘導前后淋球菌膜蛋白的變化，進而推測膜蛋白的改變在淋球菌耐CRO中的作用。 4.用抑制性消減雜交技術(SSH)篩選誘導前后淋球菌表達的差異基因，測序后送基因庫做BLAST對比分析，從而在基因水平闡明淋球菌耐CRO的機制。 結果：1.用次抑菌濃度法成功誘導出耐CRO淋球菌，誘導后淋球菌標準株(ATCC49226)和臨床

6、株對CRO的MIC值分別達到0.032μg/ml和2.0μg/ml；耐藥穩(wěn)定性試驗表明所誘導的菌株的耐藥性高度穩(wěn)定。 2.淋球菌對CRO產(chǎn)生誘導耐藥的同時，對青霉素、四環(huán)素、紅霉素及環(huán)丙沙星也產(chǎn)生耐藥或耐藥性增加，出現(xiàn)多重耐藥。 3.透射電鏡顯示淋球菌耐CRO株的膜致密染色帶比敏感株厚，提示膜的結構發(fā)生了變化；細胞分裂相增多，提示耐CRO株的生長周期發(fā)生了改變，這些改變可能使得淋球菌更好的適應生長環(huán)境。 4.膜蛋

7、白的SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳結果顯示，耐CRO淋球菌的膜孔蛋白(33kDa)的表達減少，而Mtr泵蛋白(44kDa)的表達增加，提示淋球菌對CRO的耐藥機制與孔蛋白及Mtr泵蛋白的改變有關。 5.抑制性消減雜交結果顯示，標準株(ATCC49226)耐CRO誘導前后的差異表達基因有17個，臨床株有22個；基因庫的BLAST比對分析表明，淋球菌中與耐CRO密切相關的基因有mtrR、mtrC、PDJ1質粒、rpsJ基因；隨著淋球菌產(chǎn)

8、生對CRO的耐藥性，與淋球菌復制、轉錄、翻譯、代謝及致病性等相關基因也發(fā)生了相應的改變。 結論：1.用次抑菌濃度的CRO瓊脂培養(yǎng)基能將對CRO敏感的淋球菌國際標準株(ATCC49226)和臨床株誘導成對CRO穩(wěn)定耐藥的菌株。 2.淋球菌對CRO產(chǎn)生誘導耐藥的同時，對青霉素、四環(huán)素、紅霉素及環(huán)丙沙星也產(chǎn)生耐藥或耐藥性增加，出現(xiàn)多重耐藥，機制不明。 3.膜蛋白電泳分析及SSH的結果提示外膜孔蛋白和Mtr泵蛋白的改變及