金屬硫蛋白對阿霉素心臟毒性的保護作用及其機制.pdf

1、阿霉素(DOX)為臨床常用的廣譜、高效抗腫瘤藥物，廣泛用于急慢性白血病、各種實體瘤等多種癌癥的化療。然而，DOX具有明顯的心臟毒性，嚴重限制其臨床應用。DOX在體內(nèi)代謝過程中可產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，過量的ROS攻擊心肌細胞引起氧化損傷可能是DOX致心臟毒性的主要原因。金屬硫蛋白(MT)是一類富含還原型半胱氨酸殘基的低分子量非酶蛋白，廣泛存在于哺乳動物的各種器官和組織中。目前研究發(fā)現(xiàn)MT有四種異構體，即MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT

2、-Ⅲ、MT-Ⅳ，其中以MT-Ⅰ，MT-Ⅱ為主要異構形式。通常所指的MT即為MT-Ⅰ和MT-Ⅱ，幾乎存在于機體所有的組織器官，尤其以肝臟和腎臟含量最為豐富。機體內(nèi)MT主要與Zn2+、Cd2+、Cu2+等二價金屬離子絡合，能廣泛地被重金屬、炎癥、感染、休克、饑餓、電離輻射、抗癌藥物等因素誘導表達。體外實驗研究表明，MT能有效清除細胞內(nèi)過多的自由基；體內(nèi)實驗研究提示，氧化應激狀態(tài)下MT可能對機體組織器官具有重要的保護作用，但其作用機制目前尚不

3、清楚。近年來，應用基因敲除技術建立的MT缺失小鼠動物模型為研究機體內(nèi)MT生物學功能及其作用機制提供了有力工具。本研究利用C57BL野生型小鼠及同源的MT基因(Ⅰ／Ⅱ)敲除小鼠研究DOX的心臟毒性效應，著重從氧化損傷及細胞凋亡等方面探討MT對DOX致心臟毒性的影響并探討其可能的作用機制。 1.Zn誘導金屬硫蛋白表達對阿霉素心臟毒性的保護作用及其可能機制 Zn是一種高效而且安全的MT誘導劑。近年來研究表明，Zn預處理實驗動物

4、可顯著減弱DOX所致的心肌脂質過氧化而保護心臟，但其作用機制仍不清楚。本研究采用Zn預處理野生型小鼠(MT+／+)誘導MT高表達建立MT高表達模型，結合MT缺失模型(MT-／-)，觀察MT不同表達水平對DOX致心臟損傷的影響，探討MT抗DOX心臟毒性的可能機制。MT+／+小鼠及MT-／-小鼠分別隨機分成4組，即對照組(NS+NS)、給藥組(NS+DOX)、預處理組(Zn+NS)、預處理給藥組(Zn+DOX)。動物單次腹腔注射DOX(15

5、mg／kg)或等劑量的生理鹽水(NS)，此前24h及48h分別給予ZnSO4(20mg／kg，s．c)或等劑量的NS預處理。DOX給藥后第4d，眼球采血測定血漿肌酸激酶(CK)及乳酸脫氫酶(LDH)活性；光學顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察心臟組織形態(tài)學及超微結構的改變；測定心臟組織勻漿中MT和Zn水平；分別檢測脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)及蛋白羰基化產(chǎn)物含量以觀察心肌組織脂質過氧化和蛋白氧化損傷程度；測定抗氧化物還原型谷胱甘肽(GSH)含

6、量以及組織中超氧陰離子(O2·-)濃度；WesternBlot檢測心臟組織中DOX的主要代謝酶eNOS表達情況。結果表明，Zn預處理可提高MT+／+小鼠及MT-／-小鼠心臟組織中Zn水平但僅誘導MT+／+小鼠心臟MT高表達，且MT-/-小鼠心臟MT含量顯著低于MT+／+小鼠心臟MT正常水平；DOX能引起MT+／+小鼠及MT-／-小鼠心臟嚴重的損傷，而且MT-／-小鼠心臟損傷程度比MT+／+小鼠更為明顯。具體表現(xiàn)為，光鏡及電鏡下可見心肌組

7、織明顯的的病理學改變，血漿CK、LDH活性升高，心臟組織MDA及蛋白羰基化產(chǎn)物含量增加，GSH耗竭伴隨著O2·-生成量增加以及eNOS表達上調。在MT+／+小鼠中，Zn預處理可顯著抑制DOX所致的這些心臟毒性改變；但Zn預處理再給予DOX的MT-／-小鼠心臟仍然出現(xiàn)嚴重的損傷，提示Zn預處理對DOX誘發(fā)的MT-／-小鼠心臟損傷沒有抑制作用。由此提示，Zn誘導MT表達增強可顯著抑制DOX引起的心臟損傷，機體內(nèi)基礎水平的MT對DOX心臟毒性

8、也有一定的保護作用。以上實驗結果表明，Zn誘導MT表達對DOX心臟毒性具有明顯的保護作用，其機制可能與MT體內(nèi)清除自由基的功能有關，eNOS可能在此過程中發(fā)揮重要的作用。 2．金屬硫蛋白對阿霉素致心肌線粒體損傷及細胞凋亡的影響 心肌細胞凋亡是DOX引起心肌病的主要原因。近年來體內(nèi)外實驗研究表明，自由基介導的心肌細胞凋亡可能在DOX致心肌病變過程中發(fā)揮著關鍵作用。線粒體是DOX誘發(fā)自由基產(chǎn)生的主要場所，線粒體損傷及其功能紊

9、亂是DOX致心肌細胞凋亡的早期征兆。我們假設：MT可能通過清除過多的自由基，保護心肌細胞線粒體而抑制DOX致Caspase-3的活化，從而抑制DOX引起的心肌細胞凋亡，減輕DOX的心臟毒性。MT+／+小鼠及MT-／-小鼠分別隨機分成2組，即對照組和給藥組。給藥組動物單次腹腔注射DOX(15mg／kg)，對照組給予等劑量的NS處理。給藥后第4d處死動物，迅速摘取心臟。采用透射電子顯微鏡觀察心肌線粒體形態(tài)學改變，測定心肌組織Caspase-

10、3活性，TUNEL免疫組化法檢測心肌細胞凋亡。結果表明，DOX可引起MT+／+小鼠及MT-／-小鼠心肌細胞超微結構的明顯改變，表現(xiàn)為線粒體空泡化、膜明顯皺縮甚至溶解、嵴斷裂或消失等；DOX可明顯激活Caspase-3并誘導心肌細胞凋亡，而且這些毒性損傷改變在MT-／-小鼠中更為嚴重，提示MT-／-小鼠對DOX誘導的心肌細胞凋亡更為敏感。由此表明，MT在基礎水平就能抑制DOX引起的心肌細胞線粒體損傷，抑制DOX活化心肌Caspase-3而