IL-2同源基因shRNA抗肝移植急性排斥的研究.pdf

1、第一部分大鼠lL-2shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 目的：構(gòu)建針對(duì)大鼠活化T細(xì)胞白介素一2基因編碼區(qū)的短發(fā)夾型RNA(shRNA)表達(dá)質(zhì)粒pIL-2，觀察其對(duì)大鼠活化T淋巴細(xì)胞IL-2表達(dá)的抑制效果，并篩選最佳shRNA序列。 方法：根據(jù)．RNA干擾(RNAi)作用原理設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠T淋巴細(xì)胞IL-2的shRNA，利用pGenesil-2質(zhì)粒，構(gòu)建重組干擾質(zhì)粒pIL-2A、pIL-2B及其陰性對(duì)照質(zhì)粒pIL-2C，并經(jīng)酶切

2、及測(cè)序鑒定，用脂質(zhì)體Lipofectamine轉(zhuǎn)染大鼠T淋巴細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)其對(duì)T細(xì)胞IL-2基因表達(dá)的抑制作用，并篩選最佳shRNA干擾序列。 結(jié)果：經(jīng)酶切反應(yīng)及測(cè)序證實(shí)重組干擾質(zhì)粒pIL-2A、pIL-2B及其陰性對(duì)照質(zhì)粒pIL-2C構(gòu)建成功；其中pIL-2B對(duì)活化T細(xì)胞IL一2基因的表達(dá)有較好的抑制效果，RNA水平抑制率為82％。 結(jié)論：大鼠shRNA具有明顯和特異性的抑制活化T細(xì)胞IL-2基因的表達(dá)作用。

3、 第二部分lL-2shRNA對(duì)大鼠肝移植后急性排斥反應(yīng)的抑制作用 目的：研究利用RNAi阻斷T細(xì)胞IL-2在大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用。 方法：用“二袖套法”行Lewis(Lew)鼠到BrownNorway(BN)鼠原位肝移植32例，隨機(jī)分成干擾組、環(huán)孢素組、排斥組、對(duì)照組，每組8例，分別依次于術(shù)中回輸已轉(zhuǎn)染重組干擾質(zhì)粒pIL-2B的BN鼠淋巴細(xì)胞(1ml，2×106m1-1)，生理鹽水1ml+肝

4、移植后應(yīng)用CsA(3．0mg·kg-1·d-1)肌肉注射，生理鹽水1ml,轉(zhuǎn)染空載體pGenesil-2的BN鼠淋巴細(xì)胞(1ml，2×106m1-1)。觀察各組BN鼠l周存活率，于術(shù)后第7天每組殺死BN鼠3只，取肝組織觀察病理、肝細(xì)胞凋亡及超微結(jié)構(gòu)變化，RT-PCR檢測(cè)肝組織IL-2基因的表達(dá)，ELISA檢測(cè)血清IL-2水平，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能(丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)和白蛋白(Alb))水平變化。 結(jié)果

5、：干擾組1周存活率為87．5％，環(huán)孢素組100％都明顯高于排斥組和對(duì)照組，均為37．5％；病理示干擾組、環(huán)孢素組示急性排斥反應(yīng)不明顯，排斥組和對(duì)照組示中重度急性排斥反應(yīng)；TUNEL法示肝組織中凋亡肝細(xì)胞干擾組(23±3．2／mm2)、環(huán)孢素組(264-4．0／mm2)都明顯低于排斥組(55±¨．0／mm2)和對(duì)照組(524-9．0／mm2)(p<0．05)，而與其它組相比，干擾組中匯管區(qū)凋亡淋巴細(xì)胞稍有增加(p>0．05)；電鏡示干擾組

6、、環(huán)孢素組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷都較排斥組和對(duì)照組輕；肝組織RT-PCR和血清ELISA檢測(cè)均示干擾組、環(huán)孢素組IL-2在基因表達(dá)和分泌水平均較排斥組和對(duì)照組明顯抑制(p<0．05)；干擾組和環(huán)孢素組血清TNF—Q和IFN．Y水平較排斥組和對(duì)照組明顯降低(p<0．05)；肝功能檢測(cè)示ALT和TBIL在干擾組、環(huán)孢素組都明顯低于排斥組和對(duì)照組(p<0．05)，相反，Alb則高于排斥組和對(duì)照組(p<0．05)。 結(jié)論：回輸轉(zhuǎn)染重組干擾質(zhì)