IL-2同源基因shRNA抗肝移植急性排斥的研究.pdf

1、第一部分大鼠lL-2shRNA表達質粒的構建與鑒定 目的：構建針對大鼠活化T細胞白介素一2基因編碼區(qū)的短發(fā)夾型RNA(shRNA)表達質粒pIL-2，觀察其對大鼠活化T淋巴細胞IL-2表達的抑制效果，并篩選最佳shRNA序列。 方法：根據．RNA干擾(RNAi)作用原理設計針對大鼠T淋巴細胞IL-2的shRNA，利用pGenesil-2質粒，構建重組干擾質粒pIL-2A、pIL-2B及其陰性對照質粒pIL-2C，并經酶切

2、及測序鑒定，用脂質體Lipofectamine轉染大鼠T淋巴細胞，RT-PCR檢測其對T細胞IL-2基因表達的抑制作用，并篩選最佳shRNA干擾序列。 結果：經酶切反應及測序證實重組干擾質粒pIL-2A、pIL-2B及其陰性對照質粒pIL-2C構建成功；其中pIL-2B對活化T細胞IL一2基因的表達有較好的抑制效果，RNA水平抑制率為82％。 結論：大鼠shRNA具有明顯和特異性的抑制活化T細胞IL-2基因的表達作用。

3、 第二部分lL-2shRNA對大鼠肝移植后急性排斥反應的抑制作用 目的：研究利用RNAi阻斷T細胞IL-2在大鼠原位肝移植急性排斥反應中的作用。 方法：用“二袖套法”行Lewis(Lew)鼠到BrownNorway(BN)鼠原位肝移植32例，隨機分成干擾組、環(huán)孢素組、排斥組、對照組，每組8例，分別依次于術中回輸已轉染重組干擾質粒pIL-2B的BN鼠淋巴細胞(1ml，2×106m1-1)，生理鹽水1ml+肝

4、移植后應用CsA(3．0mg·kg-1·d-1)肌肉注射，生理鹽水1ml,轉染空載體pGenesil-2的BN鼠淋巴細胞(1ml，2×106m1-1)。觀察各組BN鼠l周存活率，于術后第7天每組殺死BN鼠3只，取肝組織觀察病理、肝細胞凋亡及超微結構變化，RT-PCR檢測肝組織IL-2基因的表達，ELISA檢測血清IL-2水平，全自動生化分析儀檢測肝功能(丙轉氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)和白蛋白(Alb))水平變化。 結果

5、：干擾組1周存活率為87．5％，環(huán)孢素組100％都明顯高于排斥組和對照組，均為37．5％；病理示干擾組、環(huán)孢素組示急性排斥反應不明顯，排斥組和對照組示中重度急性排斥反應；TUNEL法示肝組織中凋亡肝細胞干擾組(23±3．2／mm2)、環(huán)孢素組(264-4．0／mm2)都明顯低于排斥組(55±¨．0／mm2)和對照組(524-9．0／mm2)(p<0．05)，而與其它組相比，干擾組中匯管區(qū)凋亡淋巴細胞稍有增加(p>0．05)；電鏡示干擾組

6、、環(huán)孢素組細胞超微結構的損傷都較排斥組和對照組輕；肝組織RT-PCR和血清ELISA檢測均示干擾組、環(huán)孢素組IL-2在基因表達和分泌水平均較排斥組和對照組明顯抑制(p<0．05)；干擾組和環(huán)孢素組血清TNF—Q和IFN．Y水平較排斥組和對照組明顯降低(p<0．05)；肝功能檢測示ALT和TBIL在干擾組、環(huán)孢素組都明顯低于排斥組和對照組(p<0．05)，相反，Alb則高于排斥組和對照組(p<0．05)。 結論：回輸轉染重組干擾質