毛竹細胞骨架微管蛋白基因PeTua3和PeTub3研究.pdf

1、竹林是我國重要的森林資源，竹材是由各種類型細胞的細胞壁及其包圍的空間所組成的復(fù)雜生物材料，因其具有強度高、韌性好、硬度大等特點而在建筑、造紙等領(lǐng)域得到廣泛的利用。竹子優(yōu)良的材性特點與其細胞壁的組成及結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，竹子細胞壁的發(fā)育對竹子的生長發(fā)育、生理特性、生化代謝以及對外界環(huán)境脅迫的有機反應(yīng)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，對竹子材性的形成起著決定性作用。細胞骨架指導(dǎo)細胞壁的生物合成，作為細胞骨架的重要組成部分，微管蛋白在細胞壁發(fā)育過程中起著重要的

2、調(diào)控作用。本研究以我國重要經(jīng)濟竹種--毛竹（Phyllostachys edulis）為材料，分離細胞骨架微管蛋白基因，在對其序列進行充分分析的基礎(chǔ)上，通過體外表達和在模式植物中的表達來驗證其功能，以其為通過基因工程手段培育竹類植物新品種奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、采用RT-PCR方法從毛竹葉片中克隆了2個微管蛋白基因，分別命名為PeTua3和PeTub3。PeTua3的編碼區(qū)為1353 bp，編碼451個氨基酸；PeT

3、ub3的編碼區(qū)1341 bp，編碼447個氨基酸。
　　2、Blast分析表明PeTua3和PeTub3與已報道的其它植物的tubulin蛋白具有很高的相似性，分別屬于 tubulin蛋白的Tua3和 Tub3家族，都是疏水性酸性蛋白。通過MOTIFSCAN軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的功能性位點，結(jié)果顯示PeTua3和PeTub3序列均包含有N-糖基化位點、磷酸化酪蛋白激酶 II位點、N-肉豆蔻?；稽c和磷酸化蛋白激酶位點、GTP酶域和C末端

4、結(jié)構(gòu)域，但是這些位點在蛋白序列中的位置、數(shù)量均存在一定的差異，這意味著它們可能存在功能上的不同。應(yīng)用MEGA4.0軟件，構(gòu)建基于tubulin蛋白的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明：PeTua3與水稻的Tua3蛋白在進化關(guān)系上最近，Petub3與牛筋草的Tub3蛋白在進化關(guān)系上最近，而與大部分雙子葉植物Tubulin蛋白的關(guān)系較遠，這與毛竹屬于單子植物禾本科竹亞科的形態(tài)學(xué)分類相吻合。
　　3、通過構(gòu)建PeTua3和PeTub3基因的原核表達載

5、體pET-32b-PeTua3和pET-30a-PeTub3，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DE3，進行基因的體外表達研究。經(jīng)過優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件，在37℃，0.4 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)2 h的條件下獲得高豐度的PeTua3可溶性重組蛋白；在28℃，0.4 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)4 h的條件下獲得高豐度的PeTub3可溶性重組蛋白。應(yīng)用His標簽親和純化方法，獲得PeTua3、PeTub3的重組

6、蛋白，并處理擬南芥種子，幼苗表現(xiàn)為上胚軸明顯增粗，側(cè)根增多，這意味著重組蛋白可能具有加快細胞的分裂的生物學(xué)活性。
　　4、構(gòu)建PeTua3和PeTub3基因的正義和反義植物表達載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥，通過抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。表型觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥（正義和反義）和野生擬南芥在發(fā)芽和莖的生長上沒有因基因的過量表達或抑制而受到影響，但對根系生長影響明顯。PeTua3和 PeTub3基因的過量表達均促進擬南芥根系生長，側(cè)根增多；石蠟切

7、片顯示根系表皮薄壁細胞數(shù)量增多，且細胞體積變大，維管柱的體積增大，約是野生擬南芥的2倍，木質(zhì)部明顯加厚。而轉(zhuǎn)反義PeTua3和PeTub3基因的擬南芥根系生長不正常，產(chǎn)生大量須根；石蠟切片顯示根系表皮薄壁細胞的數(shù)量明顯減少，且細胞體積變小，維管柱的體積變小，木質(zhì)部明顯比較薄。
　　5、在煙草懸浮細胞（BY-2）中過量表達PeTua3和PeTub3，與對照相比轉(zhuǎn)基因BY-2的G2期和 S期分裂時間明顯縮短，能顯著提高煙草細胞的有絲分

8、裂指數(shù)，細胞分裂加快。
　　細胞骨架微管蛋白基因PeTua3和PeTub3的體外表達蛋白能夠促進細胞生長，具有生物學(xué)活性，這在轉(zhuǎn)PeTua3和 PeTub3基因擬南芥中進一步得到證實，對轉(zhuǎn)PeTua3和PeTub3基因煙草懸浮細胞的觀察證實，PeTua3和PeTub3基因促進生長是通過縮短細胞分裂周期實現(xiàn)的。由此證明PeTua3和PeTub3基因具有促進細胞發(fā)育的功能，這意味著PeTua3和PeTub3基因?qū)τ诜肿佑N研究具有重要