重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的MPRO基因干預(yù)對(duì)2型糖尿病的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的:研究重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的MyostastinPropeptide(MPRO)基因重組體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的C57/6J小鼠血糖血脂及胰島素抵抗的影響及其作用機(jī)制。
　　方法:雄性,5周齡C57/6J小鼠,隨機(jī)共分為四組,每組15只,分別為普通飲食的對(duì)照組(Control組),高脂飲食誘導(dǎo)的生理鹽水(Saline組),rAAV-GFP組和rAAV-MPRO組,從第2周開始除普通飲食組外,其余組給予60％能量來自油脂的高脂飲食(D1

2、2492)。并每周監(jiān)測(cè)C57/6J小鼠體重、血糖、血脂變化,根據(jù)空腹血糖>7.0mmol/L(126mg/dl)或隨機(jī)血糖>11.1mmol/L(200mg/dl)納入實(shí)驗(yàn)組。20周后將成模小鼠進(jìn)行干預(yù),rAAV-GFP組和rAAV-MPRO組分別從尾靜脈注射rAAV-GFP和rAAV-MPRO病毒,Saline組給予相同劑量的生理鹽水,繼續(xù)監(jiān)測(cè)體重、血糖、血脂變化,同時(shí)行腹腔葡萄糖耐量及胰島素敏感試驗(yàn),了解MPRO基因?qū)57/6小鼠

3、胰島素抵抗的影響。3周后行WesternBlot檢測(cè)MPRO肌肉表達(dá)情況。行高胰島素-正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)計(jì)算葡萄糖輸注率,了解C57/6J小鼠胰島素抵抗及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)情況。繼續(xù)治療24周后處死小鼠,分離腓腸肌、脛前肌、股四頭肌、肱三頭肌、腹膜后脂肪、附睪脂肪、皮下脂肪等分別稱重,留取骨骼肌、心臟、腎臟、肝臟、主動(dòng)脈、血樣等標(biāo)本,標(biāo)本保存于-80℃冰箱備用,部分制成石蠟切片。酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)血清中血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇及低密度脂蛋

4、白含量;蘇木精-伊紅染色(H-E染色)觀察肌肉組織脂肪浸潤情況,同時(shí)觀察脂肪細(xì)胞的形態(tài)變化;免疫熒光了解葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子在細(xì)胞膜及胞漿的分布情況;WesternBlot檢測(cè)MPRO表達(dá)情況及胰島素信號(hào)通路的磷酸化水平。同時(shí)提前給予MPRO基因干預(yù),計(jì)算特殊飲食誘導(dǎo)的C57/6J小鼠2型糖尿病的發(fā)生率。
　　結(jié)果:rAAV-MPRO組相比正常對(duì)照組、rAAV-GFP組及生理鹽水組能明顯促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中以股四頭肌增長(zhǎng)

5、更為明顯(0.3475555±0.03114126g);rAAV-MPRO組棕色脂肪含量明顯增加(0.9408889±0.1329365g),皮下脂肪(3.604222±0.1673333g)和腹膜后脂肪(1.633778±0.2539753g)明顯減少且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素敏感試驗(yàn)顯示:rAAV-MPRO組在負(fù)荷葡萄糖情況下,2h內(nèi)血糖能迅速下降至接近基礎(chǔ)血糖值水平(8.450±0.1118034mmol/L)

6、,較rAAV-GFP組(15.125±0.4272002mmol/L)和Saline組(14.925±0.2217356mmol/L)葡萄糖耐量明顯改善。而在負(fù)荷胰島素劑量作用下rAAV-MPRO組,2h內(nèi)血清中血糖下降為基礎(chǔ)血糖值百分比為(71.629270±2.116367%),但是生理鹽水組和rAAV-GFP組血糖占基礎(chǔ)血糖百分比分別為(90.551050±1.940292%)和(91.020320±2.806392%),可見MP

7、RO基因干預(yù)后胰島素抵抗和葡萄糖耐量明顯改善,且血糖,胰島素水平明顯下降,但相對(duì)于正常對(duì)照組仍未能恢復(fù)正常。高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)也表明rAAV-MPRO組葡萄糖輸注率(9.900000±0.3564225mg/kg/min)相對(duì)于生理鹽水組(5.900000±0.1805342mg/kg/min)及rAAV-GFP組(6.191667±0.4740488mg/kg/min)葡萄糖輸注率明顯提高,對(duì)胰島素敏感性明顯提高。H-E染色時(shí)

8、,顯微鏡下觀察到rAAV-GFP組和生理鹽水組肌肉組織中有大量脂質(zhì)浸潤,rAAV-MPRO組脂肪浸潤明顯減輕。WesternBlot結(jié)果表示:IR,IRS,GSK,AKT磷酸化水平明顯增高,但總的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其作用機(jī)制為:rAAV-MPRO與體內(nèi)抑制肌肉生長(zhǎng)的Myostastin基因結(jié)合,而肌肉又是糖代謝的主要樞紐,通過胰島素抵抗激活胰島素通路的磷酸化水平,從而促進(jìn)糖原合成,抑制糖原分解而降低血糖。理論上對(duì)于血脂應(yīng)有一定的影響,但

9、實(shí)際上血中FFA含量變化不大,可能還與脂質(zhì)過氧化、無氧酵解、線粒體失能等多種途徑相關(guān)聯(lián)。此外我們還發(fā)現(xiàn)MPRO組促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子4從細(xì)胞漿向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移,增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。能降低C57小鼠2型糖尿病發(fā)病率,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:MPRO基因干預(yù)可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的C57小鼠高血糖水平,提高葡萄糖耐量,改善胰島素抵抗,降低糖尿病發(fā)病率。該課題初步證明通過抑制Myostastin基因,促使肌肉生長(zhǎng),降低血糖、血脂,改善胰島素抵抗