重組腺病毒介導(dǎo)的可調(diào)控人胰島素基因治療Ⅰ型糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢(shì)，在我國(guó)已成為繼惡性腫瘤和心腦血管疾患之后第三位重要的慢性非傳染性疾病。然而，現(xiàn)有的各種糖尿病的治療措施，均有一定的不足和局限性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基因治療為糖尿病治療開辟了一條嶄新的途徑。胰島素基因治療可分為生殖細(xì)胞基因治療和體細(xì)胞基因治療兩大類，而體細(xì)胞基因治療從方法上又可分為回體轉(zhuǎn)移和體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移兩種。由于技術(shù)上及倫理學(xué)上的障礙，生殖細(xì)胞基因治療目前只能用于實(shí)驗(yàn)研究，不能

2、作為用于人類的一條治療途徑。而回體轉(zhuǎn)移法選用的靶細(xì)胞均是永生化細(xì)胞系，移植體內(nèi)后可能形成移植瘤，阻礙了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。體內(nèi)直接基因轉(zhuǎn)移是基因治療糖尿病的最終目的。目前，利用基因轉(zhuǎn)移載體將胰島素基因直接導(dǎo)入體內(nèi)并使其表達(dá)成熟的胰島素已不是一件困難的事情，關(guān)鍵是在體細(xì)胞(非B細(xì)胞)中建立受葡萄糖濃度調(diào)控的胰島素分泌功能。另一方面，基因治療中還有一個(gè)不可忽視的關(guān)鍵問題就是轉(zhuǎn)移載體的安全性和轉(zhuǎn)染效率。目前，基因治療中常用的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)主要包括非

3、病毒載體系統(tǒng)和病毒載體系統(tǒng)兩大類。非病毒載體系統(tǒng)雖然具有制備簡(jiǎn)便，免疫原性較低，安全性較高等優(yōu)點(diǎn)，但其轉(zhuǎn)染效率低下、表達(dá)時(shí)間較短，很難進(jìn)一步應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)。而病毒載體系統(tǒng)，尤其是重組腺病毒，因其轉(zhuǎn)染效率高、宿主范圍廣泛、安全性高、易于制備較高滴度等優(yōu)點(diǎn)，正被越來越多地應(yīng)用于體外的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)的基因治療，是目前最常用的基因轉(zhuǎn)移載體之一。我們構(gòu)建了攜帶葡萄糖依賴性促胰島素多肽(Glucose-dependentinsulinotropic

4、polypeptide，GIP)啟動(dòng)子控制下人胰島素基因的重組腺病毒，體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染胃腸道K細(xì)胞，使K細(xì)胞獲得受葡萄糖濃度調(diào)控的胰島素表達(dá)、分泌功能，探索一條胰島素轉(zhuǎn)基因治療的有效途徑，為糖尿病的基因治療走向臨床提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。 方法：我們首先采用細(xì)胞內(nèi)同源重組法構(gòu)建攜帶GIP啟動(dòng)子控制下的人胰島素基因的非增殖型腺病毒(Ad．GIP-hlns)，通過擴(kuò)增和純化獲得病毒濃縮液。在體外實(shí)驗(yàn)中，將病毒以不同的感染復(fù)數(shù)(Multipl

5、icityOfInfection，MOI)轉(zhuǎn)染STC．1細(xì)胞，檢測(cè)病毒的感染能力；以放射免疫法測(cè)定MOI=100時(shí)重組腺病毒轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞、在不同葡萄糖濃度下培養(yǎng)液中胰島素的含量，來檢測(cè)GIP啟動(dòng)子的細(xì)胞特異性與葡萄糖反應(yīng)性。通過RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中人胰島素基因mRNA的轉(zhuǎn)錄，采用免疫組化與雙重免疫熒光定性檢測(cè)細(xì)胞中胰島素與GIP的共表達(dá)。然后，通過腸系膜上動(dòng)脈將病毒導(dǎo)入糖尿病大鼠體內(nèi)，觀察病毒轉(zhuǎn)染后糖尿病大鼠血糖、胰島素分泌及體重的變

6、化。 結(jié)果：經(jīng)PCR鑒定，證實(shí)我們成功構(gòu)建了含有目的基因的重組腺病毒Ad．GIP-hIns。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)腺病毒對(duì)STC-1細(xì)胞有較強(qiáng)的感染能力，且以MOI值為100時(shí)轉(zhuǎn)染效率最佳。以重組病毒轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞，結(jié)果表明僅在STC．1細(xì)胞內(nèi)有胰島素的表達(dá)，且在轉(zhuǎn)染后第3天就進(jìn)入表達(dá)高峰，一直持續(xù)至第七天；同時(shí)發(fā)現(xiàn)胰島素的表達(dá)量隨葡萄糖濃度升高而增加，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 RT-PCR和免疫組化分別從RNA與細(xì)胞內(nèi)蛋白水平驗(yàn)證了轉(zhuǎn)

7、染后細(xì)胞內(nèi)有胰島素基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。經(jīng)腸系膜上動(dòng)脈注入重組病毒，可以成功地轉(zhuǎn)染糖尿病大鼠腸道的K細(xì)胞，使其產(chǎn)生血糖可調(diào)節(jié)性胰島素分泌，明顯改善了糖尿病大鼠的糖耐量情況，能夠使糖尿病大鼠的血糖在一段時(shí)間內(nèi)得到一定水平的控制。 結(jié)論：我們構(gòu)建的攜帶目的基因的重組腺病毒，體外和體外實(shí)驗(yàn)均可以轉(zhuǎn)染胃腸道K細(xì)胞，使其表達(dá)胰島素，能夠使糖尿病大鼠的血糖在一段時(shí)間內(nèi)得到一定水平的控制，為將來體內(nèi)人胰島素基因治療糖尿病提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)