豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)及間接ELISA抗體診斷方法的建立.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的高度接觸性傳染病?，F(xiàn)已成為豬的一種世界性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大危害。該病臨床癥狀和流行病學(xué)與豬流行性腹瀉(PED)、豬輪狀病毒(PRV)、豬呼吸道冠狀病毒(PRC)均十分類(lèi)似，因此確診必須借助實(shí)驗(yàn)室診斷。 在TGEV的結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白是唯一能在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白。S蛋白又可包括A、B、C、D四個(gè)主要抗原位點(diǎn)

2、，不同分離株的TGEVS蛋白A、B和D位點(diǎn)高度保守，其中，A、D位點(diǎn)是主要誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的抗原位點(diǎn)。因此，S蛋白不僅是研究TGEV基因工程疫苗的主要目的基因，而且對(duì)于該病的診斷具有重要意義。本研究的目的是把S基因5’端包含A、D抗原位點(diǎn)的一段序列(TS1)克隆入桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，獲得體外表達(dá)的TS1蛋白，并將該蛋白作為診斷抗原建立間接ELISA抗體診斷方法。 本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的TGEV基因序

3、列(NC002306)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，針對(duì)s基因5’端包含A、D抗原位點(diǎn)的1077bp的序列(TS1)，并含有EcoR I、和SalI酶切位點(diǎn)。用RT-PCR技術(shù)從國(guó)內(nèi)分離的TGEV HN株中獲得大小為1077bp的PCR產(chǎn)物，將其克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a，然后在LB平板上挑取陽(yáng)性菌落，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段與預(yù)期片段大小相符；序列測(cè)定結(jié)果表明，克隆的TS1蛋白基因完

4、全符合載體閱讀框，擴(kuò)增的TS1基因與TGEV HN株核苷酸序列符合率100％，氨基酸序列符合率100％。將質(zhì)粒與穿梭載體pFastBacl分別進(jìn)行雙酶切，經(jīng)回收后連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacl-TS1，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的受體菌E.coliDH10Bac中，發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，在含慶大霉素，卡那霉素，四環(huán)素3種抗生素和X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)板上，篩選出白色菌落得到重組穿

5、梭載體Bacmid-TS1，用高分子量質(zhì)粒提取法提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性后，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，于27℃培養(yǎng)5天后出現(xiàn)細(xì)胞病變，收獲病毒?？瞻吆Y選后得到純化的重組病毒rAcV-Bac-TS1，經(jīng)RT-PCR、IFA、SDS-PAGE和Western-blotting鑒定TS1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，結(jié)果表明重組桿狀病毒TS1蛋白(約43KD)在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中得到表達(dá)。在上述工作的基礎(chǔ)上，以重組桿狀病毒TS1蛋白為診斷