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文檔簡介
1、免疫系統(tǒng)是機體在進化過程中形成的一種可以通過多種屏障來識別“自己”和“非己”的系統(tǒng)。黏膜免疫是抵抗外源入侵的第一道屏障。當(dāng)“非己”成分入侵機體后可以被機體的模式識別受體(PRRs)所識別,并引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而促進某些核轉(zhuǎn)錄因子的激活并入核進而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。其中第一個被確認(rèn)的模式識別受體就是TLRs家族。
本研究一方面通過構(gòu)建TGEV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白真核表達載體研究其對細(xì)胞FcRn表達的影響,并挖掘病毒相關(guān)蛋白的功能域
2、;另一方面研究TGEV、UV-TGEV以及TGEV蛋白引起細(xì)胞FcRn表達上調(diào)的相關(guān)TLRs信號通路。取得的主要研究成果如下:
1.TGEV對細(xì)胞FcRn表達的影響
TGEV感染PK-15細(xì)胞或IPEC-J2細(xì)胞后,通過熒光定量PCR、雙熒光素酶報告系統(tǒng)以及Western Blot實驗對細(xì)胞FcRn的mRNA和蛋白表達進行檢測。結(jié)果表明TGEV能引起細(xì)胞FcRn mRNA和蛋白表達顯著上調(diào)。
2.TGEV蛋
3、白對細(xì)胞FcRn表達的影響
本研究通過紫外線滅活TGEV,并用不同劑量的UV-TGEV刺激PK-15細(xì)胞后通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)UV-TGEV能夠顯著上調(diào)FcRn mRNA和蛋白表達水平。說明TGEV的結(jié)構(gòu)蛋白參與了細(xì)胞FcRn表達的調(diào)控。與TGEV活病毒刺激相比,UV-TGEV上調(diào)細(xì)胞FcRn程度較低,這說明除病毒核酸以外,TGEV的非結(jié)構(gòu)蛋白也可能參與了對FcRn的表達調(diào)控。
3
4、.TGEV蛋白真核表達載體的構(gòu)建
本研究通過提取TGEVWH-1株的RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并以此為模板,應(yīng)用TGEV各蛋白基因的特異性引物分別進行擴增,并將擴增產(chǎn)物回收后經(jīng)酶切連接到pCAGGS-HA真核表達載體,通過PCR擴增、酶切鑒定及測序驗證準(zhǔn)確后,再分別將各蛋白重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞。通過熒光定量PCR和Western Blot檢測FcRn的表達水平。結(jié)果表明結(jié)構(gòu)蛋白M、N和E以及非結(jié)構(gòu)蛋白nsp1、ns
5、p5、nsp7、nsp8、nsp9、nsp15均可以上調(diào)細(xì)胞FcRn的表達。
4.TGEV M和N蛋白截短表達載體的構(gòu)建
為了探究M蛋白和N蛋白調(diào)控FcRn表達的結(jié)構(gòu)功能域,本研究通過構(gòu)建不同的截短蛋白表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,通過Western Blot和熒光定量PCR實驗對細(xì)胞FcRn表達水平進行檢測。最終確定N蛋白有效功能域位于156-198位氨基酸,M蛋白有效功能域位于219-262位氨基酸。
6、5.探究TGEV上調(diào)FcRn表達的相關(guān)TLRs信號通路
本研究對TGEV、UV-TGEV以及TGEV蛋白上調(diào)細(xì)胞FcRn的表達是否通過激活TLRs相關(guān)通路進行調(diào)控展開了研究。首先將MyD88和TRIF負(fù)調(diào)控質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,再應(yīng)用TGEV和UV-TGEV刺激細(xì)胞,然后通過檢測細(xì)胞FcRn表達水平的變化,證實了TGEV和UV-TGEV均能通過TLRs通路上調(diào)細(xì)胞FcRn蛋白的表達;通過熒光定量PCR檢測證實了TGEV感染細(xì)
7、胞能夠激活TLR1、TLR2、TLR3、TLR4和TLR6的表達,UV-TGEV能夠激活TLR1和TLR2。進一步將能上調(diào)FcRn表達的各種TGEV蛋白表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)nsp1、nsp5、nsp7、nsp8、nsp9、nsp15等六種非結(jié)構(gòu)蛋白后均能顯著激活TLR1、TLR2、TLR4和TLR6,結(jié)構(gòu)蛋白E能顯著激活TLR2、TLR4和TLR6,截短蛋白N1能顯著激活TLR1、TLR4和TLR6,截短蛋白M2能激活TLR2和T
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