模擬缺血預(yù)適應(yīng)對原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與電生理功能影響的研究.pdf

1、病態(tài)竇房結(jié)綜合征是臨床常見疾病，對人類健康危害很大，有關(guān)其發(fā)病機(jī)制及防治措施的研究一直是心血管病研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一。本研究利用離體培養(yǎng)的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞，觀察模擬IP對細(xì)胞活性、離子穩(wěn)態(tài)、骨架結(jié)構(gòu)及離子通道的影響，探討模擬IP對乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制；觀察線粒體KATP通道在IP中的作用，探討KATP通道開放在IP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用環(huán)節(jié)；觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變對IP效應(yīng)的影響，探討維持骨架結(jié)構(gòu)完整性在IP中的作用意義。為防治竇房結(jié)

2、I/R損傷提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 方法：1.以Ⅱ型膠原酶為主消化分離乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞，配合差速貼壁及Brdu純化培養(yǎng)。2.在原有模擬I/R模型的基礎(chǔ)上，通過四唑鹽(MTT)比色及碘化丙啶(PI)染色檢測細(xì)胞活性，選擇最佳預(yù)適應(yīng)方案，建立有效的模擬IP模型。 3.以免疫熒光法標(biāo)記F-actin、β-tubulin、desmin、vinculin等骨架蛋白，通過激光共聚焦顯微鏡檢測模擬I/R及模擬IP后乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞骨架蛋白

3、熒光分布及熒光強(qiáng)度的變化，分析模擬IP對乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。 4.以Ca2+熒光探針負(fù)載細(xì)胞內(nèi)Ca2+，通過激光共聚焦顯微鏡定量分析模擬I/R及模擬IP后鼠竇房結(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的變化，探討模擬IP對乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)的影響。 5.通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，記錄模擬I/R及模擬IP后乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞L-型鈣電流(I-LCa)及起搏離子流(If)的變化，探討模擬IP對乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞細(xì)胞離子通道的影響。

4、 6.分別以diazoxide(線粒體KATP通道開放劑)及5-HD(線粒體KATP通道阻斷劑)干預(yù)，觀察二者對模擬I/R或模擬IP后乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)Ca2+、F-actin、β-tubulin、desmin、vinculin等骨架蛋白以及I-LCa、If的影響，觀察diazoxide是否具有藥物預(yù)適應(yīng)作用并探討線粒體KATP通道開放在IP中的意義及作用環(huán)節(jié)。 7.分別以cytochalasinD(微絲解聚劑)及c

5、olchicine(微管解聚劑)預(yù)先解聚乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞的微絲或微管，觀察骨架解體對模擬IP及diazoxide作用的影響，探討維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)完整性在IP中的作用意義。 結(jié)果：1.通過改變氧濃度以及更換模擬缺血、再灌注時(shí)pH值及離子構(gòu)成的溶液，構(gòu)建模擬IP模型，不同的模擬IP方案顯示，低于5min的預(yù)缺血刺激未能誘發(fā)IP效應(yīng)，而高于30min的累計(jì)缺血刺激同樣導(dǎo)致IP保護(hù)作用的喪失。兼顧保護(hù)效果及操作便捷性，選擇缺血10min/

6、再灌注10min×2次的模擬IP方案。 2.模擬IP能顯著減輕缺血4h/再灌注4h引起的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，增強(qiáng)細(xì)胞活性；改善模擬I/R引起的細(xì)胞骨架破壞，維持F-actin、β-tubulin、desmin、vinculin等骨架蛋白的含量并防止骨架解體，保持了細(xì)胞骨架的相對穩(wěn)定性及完整性；改善模擬I/R對If的增強(qiáng)活化以及對I-LCa的抑制，有助于保持模擬I/R后乳鼠竇房結(jié)電活動的穩(wěn)定性。 3.diazox

7、ide預(yù)處理能顯著增強(qiáng)模擬模擬I/R后的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞活性，減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，保持If及I-LCa的相對穩(wěn)定性，并維持F-actin、β-tubulin、desmin、vinculin等細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的相對完整性，模擬IP效應(yīng)；5-HD預(yù)處理則徹底阻斷了模擬IP的保護(hù)作用，使乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞活性降低，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，F(xiàn)-actin、β-tubulin、desmin、vinculin等細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞，并導(dǎo)致I-LCa的抑制及If的

8、增強(qiáng)活化。 4.缺血前以cytochalasinD或colchicine解聚微絲或微管，能阻斷模擬IP及diazoxide預(yù)處理對I-LCa及If的維護(hù)作用，使模擬I/R后乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞的電不穩(wěn)定性增強(qiáng)。 結(jié)論：1.模擬IP能顯著減輕模擬I/R導(dǎo)致的Ca2+超載，增強(qiáng)模擬I/R后的乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞活性，改善I/R后受抑的I-LCa并抑制增強(qiáng)的If，有助于維持模擬I/R后乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞的離子穩(wěn)態(tài)及電生理活動的穩(wěn)定性。