心肌缺血預(yù)適應(yīng)上調(diào)新基因Mipu1的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、鋅指是一種能與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，為鋅指蛋白中的半胱氨酸和/或組氨酸與二價(jià)的鋅離子結(jié)合形成的一種特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。鋅指蛋白可以通過(guò)與雙鏈DNA、單鏈DNA及RNA的結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及RNA剪接等功能。根據(jù)與鋅離子結(jié)合的氨基酸的不同，鋅指蛋白可以分為許多亞家族，其中C<,2>H<,2>(或Kruppel)型鋅指蛋白是其最大的亞家族，它的鋅指序列的特征為CX<,2>CX<,3>FX<,5>LX<,3>X<,3>H：兩個(gè)鋅指之間的保守序列為T(mén)G

2、EKP(Y/F)X(X代表在保守氨基酸之間的任意氨基酸)。而C<,2>H<,2>型鋅指蛋白又可以根據(jù)其N(xiāo)端含有的結(jié)構(gòu)域分成4大類(lèi)：FAX型， FAR型，POZ和KRAB型。 含KRAB結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白也稱(chēng)KRAB型鋅指蛋白(KZNF)，占人類(lèi)基因組中所有鋅指蛋白(799種)的約三分之一(290種)，是哺乳動(dòng)物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，其中超過(guò)220種在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞轉(zhuǎn)化及細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮重要功能，其表達(dá)水平隨時(shí)間和

3、空間的不同而變化。 Mipul是本室從經(jīng)歷短暫缺血一再灌注的大鼠心肌中分離克隆的新基因，Genbank登錄號(hào)為AY221750。其ORF的全長(zhǎng)為1827bp，編碼608個(gè)氨基酸。其編碼肽鏈的N-端含一KRAB結(jié)構(gòu)域，C-端含14個(gè)C<,2>H<,2>型鋅指，故為一典型的KRAB/C<,2>H<,2>型鋅指蛋白。本室近年研究發(fā)現(xiàn)，Mipul基因在缺血-再灌注心肌中表達(dá)明顯升高；Mipul過(guò)表達(dá)可減輕去血清對(duì)C<,2>C<,12>細(xì)

4、胞的生長(zhǎng)抑制作用，在去血清應(yīng)激狀態(tài)下具有促細(xì)胞生長(zhǎng)及修復(fù)損傷的功能；Mipul過(guò)表達(dá)可明顯抑制氧化應(yīng)激(H<,2>O<,2>處理)導(dǎo)致的LDH釋放率和細(xì)胞凋亡發(fā)生率，具有細(xì)胞保護(hù)功能。本文擬進(jìn)一步闡明Mipul的功能及結(jié)構(gòu)一功能關(guān)系。 為了探討新基因Mipul的DNA結(jié)合活性，首先構(gòu)建了Mipul的多個(gè)原核和真核表達(dá)質(zhì)粒。利用原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Mipul，誘導(dǎo)表達(dá)并純化了Mipul的融合蛋白GST-Mipul。將GST-Mi

5、pul固定在 Glutathione-Sepharose上后，從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選到了一個(gè)Mipul共同的DNA結(jié)合序列5'-TGTCTTATCGAA-3'。經(jīng)化學(xué)合成包含這一序列的探針，末端同位素標(biāo)記后進(jìn)行EMSA發(fā)現(xiàn)，GST-Mipul能與探針結(jié)合，并呈劑量依賴(lài)性，但純化的GST蛋白不能與探針結(jié)合；GST-Mipul與探針的結(jié)合信號(hào)能被非標(biāo)記探針(冷探針)競(jìng)爭(zhēng)，但不能被含突變核心序列(CTTA)的冷探針競(jìng)爭(zhēng)。在EMSA的結(jié)合緩沖

6、液中加入EDTA，則融合蛋白與探針的結(jié)合作用被廢除。這些結(jié)果說(shuō)明，5’-TGTCTTATCGAA-3’是Mipul的特異性DNA結(jié)合位點(diǎn)(MDBS)，其結(jié)合作用具有鋅離子依賴(lài)性，其中CTTA為結(jié)合位點(diǎn)的核心序列。為了進(jìn)一步揭示Mipul與DNA的結(jié)合作用，表達(dá)與純化了不包含KRAB結(jié)構(gòu)域及KRAB與鋅指之間的連接序列，僅包含14個(gè)鋅指的融合蛋白GST-ZF?；瘜W(xué)合成包含Mipul的特異性結(jié)合位點(diǎn)的探針，并用生物素進(jìn)行末端標(biāo)記。Targe

7、t detection asSSay顯示，探針能與融合蛋白GST-Mipul和GST-ZF結(jié)合，但不能與GST結(jié)合，并且上述結(jié)合作用具有鋅離子依賴(lài)性。 為探討Mipul中鋅指結(jié)構(gòu)域的功能，將Mipul的14個(gè)鋅指分成二大段，表達(dá)與純化了只包含部分鋅指的融合蛋白，即GST-ZF1(包含1-8個(gè)鋅指)和GST—ZF2(包含9一14個(gè)鋅指)。Target detection asssay顯示，只有其中的GST-ZF2能與探針結(jié)合。

8、 為了進(jìn)一步探討Mipul是否具有轉(zhuǎn)錄因子功能，將含三個(gè)MDBS的寡核苷酸序列插入報(bào)告基因載體pGL3-promoter構(gòu)建了重組報(bào)告基因載體pGL3-promoter—MDBS，并將三個(gè)MDBS核心序列突變構(gòu)建了突變的重組報(bào)告基因載體pGL3-promoter—MDBS<'mut>。將pGL3-promoter—MDBS和pGL3-promoter—MDBS<'mut>分別與Mipul的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3．1-Mipul共轉(zhuǎn)

9、染小鼠巨噬細(xì)胞株Raw264．7或小鼠肌原細(xì)胞株C<,2>C<,12>，經(jīng)熒光素酶測(cè)定發(fā)現(xiàn)，Mipul的過(guò)表達(dá)能抑制pGL3-promoter—MDBS的熒光素酶活性，并呈劑量依賴(lài)性，但不能抑制pGL3-promoter—MDBS<'mut>的熒光素酶活性，表明Mipul具有轉(zhuǎn)錄抑制功能。 將Mipul開(kāi)放閱讀框的全長(zhǎng)，或KRAB結(jié)構(gòu)域或鋅指(ZF)結(jié)構(gòu)域分別與綠色熒光蛋白(GFP)融合，構(gòu)建了pEGFP—Mipul、pEGFP

10、—KRAB及pEGFP—ZF三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒。將它們導(dǎo)入C<,2>C<,12> 12小時(shí)后將細(xì)胞置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，Mipul的全長(zhǎng)和KRAB定位于核，而空載體和ZF在細(xì)胞中呈散在分布。 本文進(jìn)一步對(duì)Mipul調(diào)控的靶基因進(jìn)行了初步分析。根據(jù)Mipul的DNA結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，多個(gè)促凋亡基因啟動(dòng)子區(qū)含有該結(jié)合位點(diǎn)的核心序列。將其中Bax基因啟動(dòng)子的全長(zhǎng)標(biāo)上生物素后，Target detection ass

11、ay顯示，生物素標(biāo)記的Bax的全長(zhǎng)啟動(dòng)子能與GST-ZF及GST—ZF2相互作用，表明Bax是Mipul的潛在靶基因之一。綜上所述，本研究得到如下結(jié)論：①M(fèi)ipul是一個(gè)DNA位點(diǎn)特異性的核酸結(jié)合蛋白，其特異性的結(jié)合位點(diǎn)為5’-TGTCTTATCGAA-3’，核心序列為CTTA，C-末端的六個(gè)鋅指為其與DNA結(jié)合所足夠與必需；②Mipul是一個(gè)核蛋白，其核定位信號(hào)位于KRAB結(jié)構(gòu)域或KRAB與鋅指之間的連接序列中；③Mipul是一個(gè)轉(zhuǎn)錄