三江白豬leptin的制備及其對小鼠繁殖性能和脂肪代謝的影響.pdf

1、Leptin是ob基因的表達產(chǎn)物，是由脂肪細胞分泌的一種16kDa的蛋白，與動物的采食量、能量代謝、繁殖與生產(chǎn)性能的調(diào)控有密切關(guān)系，目前國外已初步應(yīng)用于人和嚙齒類動物攝食與能量平衡的調(diào)控。但是對豬的研究才剛剛起步，因此，在體外進行其克隆表達為進一步研究leptin在改善動物繁殖性能、肉品品質(zhì)和治療人類肥胖癥方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本研究利用基因工程原理及現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)研究了如下內(nèi)容： 1．三江白豬ob基因的克隆與序列分析從

2、健康三江白豬的皮下脂肪組織中提取總RNA，根據(jù)文獻報道的豬ob基因序列設(shè)計引物，采用RT-PCR方法擴增出ob基因。并將所獲得的目的基因插入pMD18-T克隆載體，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-T-ob，然后經(jīng)雙酶切、PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒進行序列測定，基因序列分析表明與GenBank中豬ob基因的編碼序列一致為441bp，說明所克隆的基因正確。 2．三江白豬ob基因在大腸桿菌中的表達及其多克隆抗體的制備在獲得三江白豬ob基因重

3、組質(zhì)粒pMD18-T-ob的基礎(chǔ)上，成功地構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pET-28a-ob；然后將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，使用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達。SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，三江白豬ob基因在大腸桿菌中得到了正確表達。將初步純化的表達產(chǎn)物作為抗原免疫小白鼠，制每三江白豬ob基因的多克隆抗體。同時對表達產(chǎn)物進行復(fù)性。應(yīng)用ELISA檢測到較高的多克隆抗體效價(1：25600)，表明此蛋白具有良好的免疫原性。Western-

4、blot結(jié)果顯示；利用純化包涵體制備的鼠抗血清可以很好地和所表達的蛋白帶特異性結(jié)合。 3．原核表達leptin復(fù)性后對小白鼠繁殖性能及脂肪調(diào)控的研究利用小白鼠體內(nèi)實驗檢測復(fù)性后leptin的生物學(xué)活性。結(jié)果表明，復(fù)性后的leptin可使小白鼠的采食量、體重顯著降低；使小白鼠的初情期提前約6.1天；血清游離脂肪酸、甘油三酯含量也顯著下降。體內(nèi)實驗結(jié)果說明，我們所表達的leptin經(jīng)復(fù)性后具有較好的生物學(xué)活性。 本實驗獲得了