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文檔簡介
1、目的:對從牛耳楓中提取的多種生物堿進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選,以研究其是否具有抑制腫瘤增殖作用,井對其抗腫瘤活性的有效成分做進(jìn)一步的藥理研究,從而探明其抗腫瘤作用機制及對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響,為從該類植物中開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供理論實驗依據(jù)
方潔
1采用MTT法檢測牛耳楓生物堿對HeLa(人宮頸癌細(xì)胞株) A-549(人肺腺癌細(xì)胞株) MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞株) HePG-2(人肝癌細(xì)胞株)和U-251(人神經(jīng)膠質(zhì)
2、瘤細(xì)胞株)等5種腫瘤細(xì)胞株的體外抗腫瘤活性。采用6.25,12.5,25,5O,1OO ug/mL的樣品終濃度,研究牛耳楓生物堿作用于細(xì)胞2448及72h后,對不同腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制作用井計算半數(shù)抑制濃度(1C5O),以篩選抗腫瘤活性較強的成分及敏感腫瘤細(xì)胞株。
2采用瑞-姬染色光學(xué)顯微鏡觀察 FDA-P1雙染熒光顯微鏡觀察 DNA瓊脂糖凝膠電泳 Annexin V-F1TC/P1雙染流式細(xì)胞儀檢測及蛋白酶學(xué)分析等手段,在細(xì)
3、胞分于水平初步研究抗腫瘤活性較好的化學(xué)成分2-hydroxyyunnandaPhnine D對敏感瘤株HePG-2細(xì)胞的抗腫瘤作用機制,為進(jìn)一步探討其生物學(xué)活性奠定基礎(chǔ)
3采用MTT法檢測2-hydroxyyunnandaPhnine D對小鼠靜止及絲裂原激活的脾淋巴細(xì)胞增殖的影響,探討2-hydroxyyunnandaPhnine D對機體免疫毒理作用
結(jié)果
1牛耳楓生物堿抗腫瘤活性的初步篩選
4、16種牛耳楓生物堿抗腫瘤活性篩選結(jié)果顯示,2-hydroxyyunnandaPhnine D在體外具有較強的抗腫瘤活性,其對HeLa A-549 MCF-7 HePG-2和U-251等5種腫瘤細(xì)胞株均有一定的抑制作用,其中對HePG-2細(xì)胞的抑制增殖作用最強,其24,48和72 h的1C5O值分別為(5.3±O.1),(1.3±O.O)和(O.13±O.1)ug/mL,且具有量效(F=232.39,P<O.O5)和時效(F=65.59,
5、P<O.O5)關(guān)系
2作用機制的研究
?。?)瑞姬氏染色形態(tài)學(xué)觀察
倒置顯微鏡下觀察到正常對照組的細(xì)胞膜完整,胞漿呈藍(lán)色,胞質(zhì)均勻,細(xì)胞核完整,染成紫紅色,核仁明顯2-hydroxyyunnandaPhnine D1Oug/mL處理HePG-2細(xì)胞48 h后,細(xì)胞體積增大,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞核周圍出現(xiàn)大量空泡,且密度降低,但細(xì)胞膜及細(xì)胞核保持完整2-hydroxyyunnandaPhnine D3O ug/mL處理4
6、8 h后,細(xì)胞膜完整性被破壞,胞漿內(nèi)有空泡形成,細(xì)胞核破碎,且密度降低。1OO ug/mL組處理后細(xì)胞破壞嚴(yán)重,細(xì)胞形態(tài)消失。
?。?)FDA-P1雙染熒光顯微鏡觀察
正常對照組中細(xì)胞絕大部分發(fā)綠色熒光為有活力細(xì)胞,個別細(xì)胞發(fā)紅色熒光,可能為自然死亡細(xì)胞。1O3O ug/mL2-hydroxyyunnandaPhnine D組中發(fā)紅色熒光的細(xì)胞有所增加,說明細(xì)胞壞死或晚期凋亡增多,sTs組中以發(fā)紅色熒光細(xì)胞為主,細(xì)胞死
7、亡明顯,表明2-hydroxyyunnandaPhnine D可使細(xì)胞死亡
(3)瓊脂糖凝膠電泳
檢測結(jié)果顯示。2-hydroxyyunnandaPhnine D1O,3O和1OO ug/mL處理HePG-2細(xì)胞48h后,均未見特征性的DNA梯狀條帶。
?。?)Annexin V-F1TC/P1雙染流式細(xì)胞儀檢測凋亡及細(xì)胞周期檢測
HePG-2細(xì)胞分別經(jīng)2-hydroxyyunnandaPhnine
8、 D處理244872h后,早期細(xì)胞凋亡率與正常對照組無明顯變化(P>0.05),晚期凋亡率和壞死率明顯增加(P<0.05),有統(tǒng)計學(xué)意義2-hydroxyyunnandaPhnine D1O3O和1OO ug/mL處理48 h后,HePG-2細(xì)胞晚期凋亡率分別(17.34±O.O1)%,(25.45±O.OO)%和(43.67±O.O3)%,與正常對照組比較,均有顯著差異(P<0.05),且隨濃度增加,其凋亡率也增加(P<0.05)。細(xì)
9、胞周期分布表明藥物處理72h后,各濃度組細(xì)胞周期表均出現(xiàn)一個明顯的異倍體峰
?。?)凋亡抑制劑z-VAD-FMk對2-hydroxyyunnandaPhnine D活性的影響
結(jié)果顯示。z-VAD-FMk可明顯抑制星形抱菌素sTs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡1O3O ug/mL2-hydroxyyunnandaPhnine D組的增殖抑制率分別為(18.42±O.O9)%和(42.77±O.O1)%,而1O3O ug/mL2-hyd
10、roxyyunnandaPhnine D+z-VAD-FMk組的增殖抑制率分別為(16.46±O.OO)%和(44.O1±O.OO)%,2-hydroxyyunnandaPhnine D與相應(yīng)的2-hydroxyyunnandaPhnine D+z-VAD-FMk組之間均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)
?。?)casPase-3酶活力檢測
lO3O ug/mL2-hydroxyyunnandaPhnine D組的CasP
11、ase-3酶活力單位與正常對照組比較均無顯著差異,無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明2-hydroxyyunnandaPhnine D未激活casPase酶,即不是通過激活casPase途徑引起腫瘤細(xì)胞凋亡
3對免疫細(xì)胞功能的影響
2-hydroxyyunnandaPhnine D除小濃度組對靜止的小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用無影響外,其它組均對靜止的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有顯著抑制作用。各濃度組2-hydroxyyunnand
12、a-Phnine D均可抑制 LPs激活的小鼠脾臟 b淋巴細(xì)胞及conA激活的T淋巴細(xì)胞增殖,且具有量效關(guān)系
結(jié)論
12-hydroxyyunnandaPhnine D體外可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,其中抗 HePG-2作用最強,且具有明顯的時-效和量-效關(guān)系依賴性。
22-hydroxyyunnandaPhnine D抗腫瘤作用機制井非通過激活 CasPase酶而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,可能通過 ParaPtos
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