牛耳楓生物堿體外抗腫瘤活性成分篩選及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：對(duì)從牛耳楓中提取的多種生物堿進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選，以研究其是否具有抑制腫瘤增殖作用，井對(duì)其抗腫瘤活性的有效成分做進(jìn)一步的藥理研究，從而探明其抗腫瘤作用機(jī)制及對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，為從該類植物中開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供理論實(shí)驗(yàn)依據(jù)
　　方潔
　　1采用MTT法檢測(cè)牛耳楓生物堿對(duì)HeLa（人宮頸癌細(xì)胞株） A-549（人肺腺癌細(xì)胞株） MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞株） HePG-2（人肝癌細(xì)胞株）和U-251（人神經(jīng)膠質(zhì)

2、瘤細(xì)胞株）等5種腫瘤細(xì)胞株的體外抗腫瘤活性。采用6.25，12.5，25，5O，1OO ug／mL的樣品終濃度，研究牛耳楓生物堿作用于細(xì)胞2448及72h后，對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制作用井計(jì)算半數(shù)抑制濃度（1C5O），以篩選抗腫瘤活性較強(qiáng)的成分及敏感腫瘤細(xì)胞株。
　　2采用瑞-姬染色光學(xué)顯微鏡觀察 FDA-P1雙染熒光顯微鏡觀察 DNA瓊脂糖凝膠電泳 Annexin V-F1TC／P1雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)及蛋白酶學(xué)分析等手段，在細(xì)

3、胞分于水平初步研究抗腫瘤活性較好的化學(xué)成分2-hydroxyyunnandaPhnine D對(duì)敏感瘤株HePG-2細(xì)胞的抗腫瘤作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討其生物學(xué)活性奠定基礎(chǔ)
　　3采用MTT法檢測(cè)2-hydroxyyunnandaPhnine D對(duì)小鼠靜止及絲裂原激活的脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，探討2-hydroxyyunnandaPhnine D對(duì)機(jī)體免疫毒理作用
　　結(jié)果
　　1牛耳楓生物堿抗腫瘤活性的初步篩選
　　

4、16種牛耳楓生物堿抗腫瘤活性篩選結(jié)果顯示，2-hydroxyyunnandaPhnine D在體外具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，其對(duì)HeLa A-549 MCF-7 HePG-2和U-251等5種腫瘤細(xì)胞株均有一定的抑制作用，其中對(duì)HePG-2細(xì)胞的抑制增殖作用最強(qiáng)，其24，48和72 h的1C5O值分別為（5.3±O.1），（1.3±O.O）和（O.13±O.1）ug／mL，且具有量效（F=232.39，P＜O.O5）和時(shí)效（F=65.59，

5、P＜O.O5）關(guān)系
　　2作用機(jī)制的研究
　?。?）瑞姬氏染色形態(tài)學(xué)觀察
　　倒置顯微鏡下觀察到正常對(duì)照組的細(xì)胞膜完整，胞漿呈藍(lán)色，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核完整，染成紫紅色，核仁明顯2-hydroxyyunnandaPhnine D1Oug／mL處理HePG-2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞核周圍出現(xiàn)大量空泡，且密度降低，但細(xì)胞膜及細(xì)胞核保持完整2-hydroxyyunnandaPhnine D3O ug／mL處理4

6、8 h后，細(xì)胞膜完整性被破壞，胞漿內(nèi)有空泡形成，細(xì)胞核破碎，且密度降低。1OO ug／mL組處理后細(xì)胞破壞嚴(yán)重，細(xì)胞形態(tài)消失。
　?。?）FDA-P1雙染熒光顯微鏡觀察
　　正常對(duì)照組中細(xì)胞絕大部分發(fā)綠色熒光為有活力細(xì)胞，個(gè)別細(xì)胞發(fā)紅色熒光，可能為自然死亡細(xì)胞。1O3O ug／mL2-hydroxyyunnandaPhnine D組中發(fā)紅色熒光的細(xì)胞有所增加,說(shuō)明細(xì)胞壞死或晚期凋亡增多，sTs組中以發(fā)紅色熒光細(xì)胞為主，細(xì)胞死

7、亡明顯，表明2-hydroxyyunnandaPhnine D可使細(xì)胞死亡
　?。?）瓊脂糖凝膠電泳
　　檢測(cè)結(jié)果顯示。2-hydroxyyunnandaPhnine D1O，3O和1OO ug／mL處理HePG-2細(xì)胞48h后，均未見特征性的DNA梯狀條帶。
　?。?）Annexin V-F1TC／P1雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè)
　　HePG-2細(xì)胞分別經(jīng)2-hydroxyyunnandaPhnine

8、 D處理244872h后，早期細(xì)胞凋亡率與正常對(duì)照組無(wú)明顯變化（P＞0.05），晚期凋亡率和壞死率明顯增加（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義2-hydroxyyunnandaPhnine D1O3O和1OO ug／mL處理48 h后，HePG-2細(xì)胞晚期凋亡率分別（17.34±O.O1）％,（25.45±O.OO）％和（43.67±O.O3）％，與正常對(duì)照組比較，均有顯著差異（P＜0.05）,且隨濃度增加，其凋亡率也增加（P＜0.05）。細(xì)

9、胞周期分布表明藥物處理72h后，各濃度組細(xì)胞周期表均出現(xiàn)一個(gè)明顯的異倍體峰
　?。?）凋亡抑制劑z-VAD-FMk對(duì)2-hydroxyyunnandaPhnine D活性的影響
　　結(jié)果顯示。z-VAD-FMk可明顯抑制星形抱菌素sTs誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡1O3O ug／mL2-hydroxyyunnandaPhnine D組的增殖抑制率分別為（18.42±O.O9）％和（42.77±O.O1）％，而1O3O ug／mL2-hyd

10、roxyyunnandaPhnine D+z-VAD-FMk組的增殖抑制率分別為（16.46±O.OO）％和（44.O1±O.OO）％,2-hydroxyyunnandaPhnine D與相應(yīng)的2-hydroxyyunnandaPhnine D+z-VAD-FMk組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）
　?。?）casPase-3酶活力檢測(cè)
　　lO3O ug／mL2-hydroxyyunnandaPhnine D組的CasP

11、ase-3酶活力單位與正常對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明2-hydroxyyunnandaPhnine D未激活casPase酶，即不是通過激活casPase途徑引起腫瘤細(xì)胞凋亡
　　3對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響
　　2-hydroxyyunnandaPhnine D除小濃度組對(duì)靜止的小鼠脾淋巴細(xì)胞的作用無(wú)影響外，其它組均對(duì)靜止的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖有顯著抑制作用。各濃度組2-hydroxyyunnand

12、a-Phnine D均可抑制 LPs激活的小鼠脾臟 b淋巴細(xì)胞及conA激活的T淋巴細(xì)胞增殖，且具有量效關(guān)系
　　結(jié)論
　　12-hydroxyyunnandaPhnine D體外可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其中抗 HePG-2作用最強(qiáng)，且具有明顯的時(shí)-效和量-效關(guān)系依賴性。
　　22-hydroxyyunnandaPhnine D抗腫瘤作用機(jī)制井非通過激活 CasPase酶而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可能通過 ParaPtos