6-OHDA誘導(dǎo)帕金森病大鼠模型行為學(xué)評價(jià)方法的探討及龍膽苦苷對該模型神經(jīng)保護(hù)作用的研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一種中老年人群中常見的神經(jīng)變性疾??；它以黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失、紋狀體多巴胺水平降低為主要特點(diǎn)，給老年人及其家庭帶來很大痛苦。其臨床特征主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動遲緩、姿勢不穩(wěn)。PD的病因多種且發(fā)病機(jī)制尚不完全明確。
　　6-羥多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）是神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的羥基化衍生物，于1959年首先被Senoh等人成

2、功分離，能高選擇地引起交感神經(jīng)腎上腺素能神經(jīng)末梢急性潰變，在1968年，Ungerstedt研究顯示,向黑質(zhì)致密部注射6-OHDA能夠?qū)е潞谫|(zhì)紋狀體的多巴胺系統(tǒng)順行性變性，從而生成第一個制備帕金森病的動物模型。本課題利用6-OHDA定向定量注射SD大鼠左腦紋狀體誘導(dǎo)帕金森病模型。
　　龍膽苦苷(Gentiopicroside)是龍膽和秦艽的有效成分之一，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、利膽、健胃、抗氧化等廣泛的生物學(xué)活性，本課題組前期研究發(fā)

3、現(xiàn)其能抑制 MPP+誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞 IκBα降解，抑制NF-κB炎癥信號通路的激活，降低通路相關(guān)產(chǎn)物tm TNF-α、IL-1β、iNOS的表達(dá)水平，降低由炎癥刺激細(xì)胞MMP-9的表達(dá)水平，表明龍膽苦苷在以神經(jīng)炎癥為靶點(diǎn)，對PD的預(yù)防和治療可能具有一定的潛在價(jià)值。但其在帕金森病動物模型上的神經(jīng)保護(hù)作用未見報(bào)道。
　　建立從秦艽中提取龍膽苦苷的提取工藝；建立6-OHDA誘導(dǎo)帕金森病模型的行為學(xué)評價(jià)體系，為藥物治療該疾病提供

4、科學(xué)評價(jià)方法；初步探討龍膽苦苷對6-OHDA誘導(dǎo)帕金森病模型的神經(jīng)保護(hù)作用，為PD神經(jīng)變性的防治和新藥研發(fā)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本課題首先應(yīng)用 SP70大孔樹脂和硅膠提純法從秦艽水提物中分離提純龍膽苦苷；通過向左側(cè)腦紋狀體注射定量6-OHDA溶液建立體內(nèi)誘導(dǎo)損傷PD模型，3周后通過腹腔注射阿撲嗎啡(0.5mg/kg)觀察已造模大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)情況來確定造模是否成功（≥7r/min即視為造模成功），分別應(yīng)用轉(zhuǎn)棒和曠場分析測定動物的

5、運(yùn)動功能，應(yīng)用肌電測試實(shí)驗(yàn)測定大鼠的震顫幅度；行為學(xué)評價(jià)組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評價(jià)與分析，建立行為學(xué)評價(jià)體系；治療組大鼠連續(xù)給藥2周后再次檢測上述行為學(xué)并分析各劑量組藥效，同時與給藥前數(shù)據(jù)比較；通過免疫組化方法檢測大鼠腦部左側(cè)黑質(zhì)中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)減少情況，探討龍膽苦苷的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　從秦艽中提取龍膽苦苷，實(shí)驗(yàn)方法較以往提取工藝創(chuàng)新可行，提取物更加純化，雜質(zhì)較少，HPLC檢測更接近龍

6、膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)品；6-OHDA定量注射左腦紋狀體造模后，腹腔注射給予阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯升高，說明造模成功；轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中部分大鼠在棒時間顯著縮短，曠場實(shí)驗(yàn)中橫向跨格次數(shù)減少，出現(xiàn)運(yùn)動功能障礙；肌電檢測結(jié)果顯示部分大鼠肌肉震顫頻率和幅度均增加。對行為學(xué)數(shù)據(jù)分析得出帕金森病分類：震顫型、運(yùn)動障礙型和混合型；6-OHDA定量注射左腦紋狀體造模后，腹腔注射給予阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯升高，說明造模成功；與假手術(shù)組相比，轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中大鼠在棒時間明顯減

7、少，曠場實(shí)驗(yàn)中大鼠活動減少，肌電實(shí)驗(yàn)中大鼠出現(xiàn)不自主震顫，且振幅增大，顯著性差異；連續(xù)給藥2周后，龍膽苦苷各劑量組與陽性藥組均有所改善，但大劑量組改善顯著，30min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯少于模型組，在棒時間延長，活動增加，不自主震顫的振幅減小，與模型組相比有顯著差異；龍膽苦苷高劑量組和陽性藥組可明顯提高TH免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)目，改善TH陽性細(xì)胞狀態(tài)。
　　從秦艽中提取龍膽苦苷，實(shí)驗(yàn)方法較以往提取工藝創(chuàng)新可行，提取物更加純化，雜質(zhì)較少；帕

8、金森病行為學(xué)體系的建立能夠?qū)ε两鹕「玫姆中?，這對某些藥物針對帕金森病不同的發(fā)病癥狀和種類治療效果不佳加以解釋并歸類，以期對該病的對癥治療有所助益；龍膽苦苷各劑量組對帕金森病的運(yùn)動障礙、肌肉疲勞度和不自主震顫有所改善，其中大劑量組的改善作用明顯，且尤其對振幅改善顯著，說明龍膽苦苷可能對帕金森病不自主震顫療效優(yōu)于其他行為學(xué)，有可能是治療震顫型帕金森病的潛在藥物之一。龍膽苦苷明顯增加TH陽性細(xì)胞數(shù)目提示其可以改善帕金森病多巴胺數(shù)目的減少。