蘿卜硫素對(duì)肺氣腫大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響.pdf

1、目的：
　　探討蘿卜硫素（ Sulforaphane， SFN）對(duì)肺氣腫大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（ alveolar macrophage，AM）分泌腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）的影響。
　　方法：
　　1．肺氣腫大鼠模型構(gòu)建：采用脂多糖聯(lián)合熏煙法構(gòu)建模型。取SPF級(jí)成年雄性wistar大鼠18只，隨機(jī)分為對(duì)照組（6只）和模型組（12只）。模型組大鼠分別于d1、d14氣管內(nèi)滴注200μ

2、g脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS；生理鹽水配制成200μg/200μL溶液)，第2~60天（除d14）在自制熏煙箱被動(dòng)吸香煙，2次/日，12支/次，30min/次，持續(xù)8周；對(duì)照組大鼠以生理鹽水替代脂多糖行氣管滴注，正常空氣吸入。8周后，取各組大鼠右肺后葉做病理切片，HE染色光鏡下觀察，鑒定模型；2．原代肺泡巨噬細(xì)胞提取及干預(yù)：造模成功后，兩組大鼠均行支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage,

3、BAL），取灌洗液行細(xì)胞計(jì)數(shù)，提取、純化AM，用不同濃度SFN（0μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L）干預(yù)肺氣腫大鼠AM16 h。依處理方法不同，將AM分為五組：對(duì)照組、SFN0組、SFN5組、SFN10組和SFN20組；3．實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)：3.1采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量；3.2采用蛋白印跡法（Western blot）分別檢測(cè)各組AM中轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子

4、2（Nrf2）及其下游的靶基因醌氧化還原酶1（NQO1）、血紅素氧合酶-1（HO1）蛋白相對(duì)表達(dá)量；3.3采用western blot法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法分別檢測(cè)各組AM中核因子（Nuclear factor，NF）-κB蛋白及其mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.造模前對(duì)照組與模型組大鼠體重比較無(wú)明顯差異（211.97±8.71 g VS206.32±6.52 g，p＞0.05）。經(jīng)熏煙8周后，模

5、型組大鼠體重較對(duì)照組顯著下降（567.48±24.38 g VS358.86±20.75 g，P<0.01）；2．模型組大鼠支氣管肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）中白細(xì)胞總數(shù)及AM比例均較對(duì)照組顯著增加，分別為（2.79±0.42）×106/mL，（98.7±1.0）％和(0.77±0.16)×106/mL，（90.0±2.5）%（均P<0.001）；3．TNF-α在SFN各濃度組中含量

6、均高于對(duì)照組（對(duì)照組：12.2±2.7 pg/mL；SFN0:150.7±11.0 pg/mL；SFN5:133.1±13.7 pg/mL；SFN10:65.3±14.8 pg/mL；SFN20：48.2±11.1 pg/mL），且隨SFN干預(yù)濃度增加，TNF-α含量呈逐漸下降（均P<0.05）；4．與對(duì)照組相比，SFN0組Nrf2蛋白胞核表達(dá)減少，胞漿表達(dá)增加（均P<0.05），隨SFN干預(yù)濃度增加，Nrf2胞核表達(dá)量逐漸增加，胞漿相

7、應(yīng)減少（均P<0.05）；5．與對(duì)照組相比，SFN0組NQO1、HO1蛋白表達(dá)減少；隨SFN干預(yù)濃度增加，NQO1、HO1蛋白表達(dá)逐漸增加（均P<0.05），且NQO1、HO1表達(dá)量與各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.918，P<0.01；r=-0.939，P<0.01）；6．對(duì)照組AM中NF-κB蛋白的胞漿表達(dá)大于胞核。與對(duì)照組相比，SFN0組NF-κB蛋白胞核表達(dá)顯著增加，胞漿表達(dá)減少（均P<0.05）；隨SFN

8、干預(yù)濃度增加，NF-κB胞核表達(dá)逐漸減少，胞漿表達(dá)相應(yīng)增加（均P<0.05）；7．與對(duì)照組相比，SFN各濃度組NF-κB mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組（均P<0.05），但SFN各濃度組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論:
　　1．蘿卜硫素抑制肺氣腫大鼠肺泡巨噬細(xì)胞釋放TNF-α；2．蘿卜硫素通過(guò)促進(jìn)Nrf2核內(nèi)移，增加下游靶基因NQO1、HO1轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而抑制AM釋放TNF–α；3．蘿卜硫素通過(guò)減少NF-κB核內(nèi)