RNA干擾對小鼠脾淋巴細胞分泌TNF-α的影響.pdf

1、目的：腫瘤壞死因子(tumornectosisfactor-α，TNF-α)由活化的巨噬細胞和T淋巴細胞產生，是一類重要的細胞因子，TNF-α具有廣泛的生物學活性。最初對TNF-α功能的認識僅限于對腫瘤特異性殺傷作用，后來發(fā)現(xiàn)TNF-α也具有免疫調節(jié)作用，而且參與某些炎癥反應過程。適量的TNF-α可以調節(jié)機體免疫功能，對維持機體內部的穩(wěn)定狀態(tài)及抵御各種致病因子具有重要意義，然而，TNF-α的異常分泌可作為機體炎癥、損傷及休克的重要介質。

2、目前已知與TNF-α有關的疾病包括：AIDS、貧血、自身免疫性疾病、腫瘤、出血性休克、移植排斥反應、結核病、白血病、糖尿病、類風濕性關節(jié)炎等。TNF-α參與了眾多疾病的發(fā)生發(fā)展過程，因此，在不同水平上阻斷TNF-α的作用，有可能對與TNF-α有關的疾病產生治療作用。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是利用具有同源性互補序列的雙鏈RNA誘發(fā)序列特異性的轉錄后基因沉默現(xiàn)象，它可以通過抑制蛋白表達來模擬基因敲除技術，RNA

3、干擾在植物、真菌及動物細胞中均存在，在抗腫瘤、抗病毒及研究基因功能等方面都有著廣泛的應用前景。抑制效果有明顯的高效性、特異性。本實驗利用SilentgeneTMU6試劑盒在體外經(jīng)PCR合成siRNA表達載體，利用脂質體轉染入細胞后，轉錄出siRNA引發(fā)干擾。針對小鼠TNF-α基因選取2個靶位點，測定并比較其干擾效果，從而選出敏感的抑制位點，為今后克隆質粒提供最強的干擾序列。本文就位點1干擾作用加以論述。 方法：1.小鼠脾淋巴細胞

4、的培養(yǎng)：C57BL/6小鼠，雄性(中國醫(yī)科大學動物部提供)，頸椎脫臼法處死，0℃無菌條件下取脾，尼龍網(wǎng)上研磨，過濾制成細胞懸液，用淋巴細胞分層液分離脾淋巴細胞，完全DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度，1×105個/ml，接種96孔板。 2.淋巴細胞TNF-α產生能力的檢測：細胞正常生長后，每孔加10μg/mlLPS，10μl/孔，作用6小時后，去除刺激，分別于終止刺激24h、36h、48h、60h取出細胞培養(yǎng)液上清，測TNF-α濃度。

5、 3.實驗分組：共分4組，干擾組：給予針對TNF-α位點1的siRNA表達載體。陽性對照組：給予針對非同源siRNA表達載體，這里選擇的是靶向IL-1某一位點的序列。陰性對照組：給予正常DMEM培養(yǎng)液。轉染對照組：給予表達GFP的pEGFP-N1質粒。前3組收集細胞上清，用ELISA方法檢測TNF-α、IL-1的分泌量。轉染對照組用熒光顯微鏡觀察GFP的表達。 4.干擾組及陽性對照組siRNA表達載體的獲得及檢測：從Gen

6、eBank中查找C57BL/6小鼠TNF-α、IL-1的序列。根據(jù)靶序列篩選原則及pro-mega公司siRNAtargetDisigner設計軟件，經(jīng)BLAST對比后，選擇出編碼靶標RNA的基因序列，由上海生工公司合成干擾組及陽性對照組下游引物，利用SilentgeneTMU6試劑盒經(jīng)PCR反應合成siRNA表達載體，純化后，用2％瓊脂糖凝膠電泳分析。 5.RNA干擾作用特異性的測定：IL-1為淋巴細胞分泌的又一重要的細胞因子

7、，將其作為陽性對照，分泌受到了抑制，可說明RNAi作用特異性。 6.轉染對照組所需pEGFP-N1質粒的制備及轉染：經(jīng)典方法擴增pEGFP-N1質粒，堿裂解法制備質粒DNA，純化后轉染淋巴細胞。 7.干擾：獲取淋巴細胞在體外培養(yǎng)正常生長后，每組分別給予對應的轉染試劑，干擾組、陽性對照組、陰性對照組取細胞培養(yǎng)液上清，檢測TNF-α、IL-1濃度，轉染對照組在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況。 8.細胞因子的檢測：用

8、ELISA方法檢測TNF-α、IL-1的分泌情況，操作步驟嚴格按說明書進行。 結果：1.LPS刺激淋巴細胞分泌TNF-α的動態(tài)變化：LPS停止刺激24小時起，TNF-α的分泌開始上升，48小時達到高峰，48小時后開始下降。 2.干擾組及陽性對照組siRNA表達載體的獲得及檢測：干擾組下游引物，引物A序列：(將給出反義RNA)5'CAAAAACTGTAAAAA-GAGCACAGAAAGCATGATC-GGTGTTTCGTC

9、CTTTCCACAAGA3'引物B序列：(將給出有義RNA)5'CAAAAACTGTAAAAA-GATCATGCTTTCTGTGCTC-GGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA3'陽性對照組下游引物：引物A序列：(將給出反義RNA)5'CAAAAACTGTAAAAA-GCAAGCTATGGCTCACTTC-GGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA3'引物B序列：(將給出有義RNA)5'CAAAAACTGTAAAAA-GAAG

10、TGAGCCATAGCTTGC-GGTGTTTCGTCCTTTCCACAAGA3'下游引物合成后，利用SilentgeneTMU6試劑盒經(jīng)PCR反應合成siRNA表達載體。 2％瓊脂糖電泳檢測純化后的PCR產物(見圖4)3.RNA干擾作用對TNF-α濃度的影響：干擾組TNF-α分泌量較陽性對照組及陰性對照組均明顯降低。P＜0.05。 4.RNA干擾作用序列特異性：陽性對照組IL-1分泌量較干擾組及陰性對照組均明顯降低。P

11、＜0.05。 5.pEGFP-N1質粒轉染效果的觀察：熒光顯微鏡下可見細胞發(fā)出翠綠色熒光。 結論：1.RNA干擾可以有效的抑制原代培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞TNF-α的分泌。 2.RNA干擾有嚴格的序列特異性。 3.針對位點1的干擾作用可以抑制小鼠脾淋巴TNF-α的分泌，該位點可以作為今后克隆質粒研究的敏感位點。 總之，RNA干擾特異性抑制了哺乳動物淋巴細胞TNF-α的分泌，為TNF-α相關疾病在基因水