自噬對(duì)SiO2誘發(fā)大鼠矽肺過(guò)程的影響.pdf

1、背景與目的：
　　矽肺是目前我國(guó)最重要的職業(yè)病，是由于長(zhǎng)期吸入大量游離二氧化硅(SiO2)粉塵所引起，以肺部廣泛的結(jié)節(jié)性纖維化為主的疾病。主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、肺泡單位結(jié)構(gòu)紊亂和肺纖維化，最終導(dǎo)致肺臟結(jié)構(gòu)和功能的嚴(yán)重破壞。肺泡巨噬細(xì)胞及其溶酶體的功能在矽肺發(fā)病過(guò)程中起重要作用。自噬(autophagy)是指從雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體(autophagosome)，并與溶酶體融合形成自噬溶酶

2、體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬的功能很廣泛，可能參與多種疾病的發(fā)病過(guò)程，包括肝臟和腎臟的纖維化，但是，自噬對(duì)矽肺形成過(guò)程是否有影響目前還未見(jiàn)報(bào)道。本研究的目的是為了觀察自噬在SiO2誘導(dǎo)大鼠矽肺形成過(guò)程中的作用。
　　方法：
　　雄性SD大鼠60只，體重150-200g，根據(jù)初始體重將大鼠隨機(jī)分成5組，每組12只，并平均分為兩個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)（2個(gè)月與4個(gè)月）。1組為陰性對(duì)照組，一次性

3、氣管內(nèi)灌注生理鹽水，此后隔日用生理鹽水灌胃;2組為氯喹對(duì)照組，一次性氣管內(nèi)灌注生理鹽水，此后隔日用生理鹽水灌胃;3組為SiO2模型組，一次性氣管內(nèi)灌注SiO250mg/只;4組為SiO2模型組，一次性氣管內(nèi)灌注SiO250mg/只，此后隔日灌胃給氯喹50mg/kg;5組為氯喹預(yù)處理組，先隔日灌胃給氯喹50mg/kg，持續(xù)2周，然后一次性氣管內(nèi)灌注SiO250mg/只，此后隔日灌胃給氯喹50mg/kg。實(shí)驗(yàn)期間每日觀察大鼠活動(dòng)、進(jìn)食情況和

4、可能出現(xiàn)的體征，每周隔天一次稱重，觀察生長(zhǎng)情況。染塵2個(gè)月時(shí)各組處死一半動(dòng)物，稱量大鼠體重，解剖后分離肺臟稱重，并計(jì)算肺系數(shù)。取肺組織常規(guī)病理制片，HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變，MASSON染色觀察肺纖維化，透射電鏡觀察肺巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。Western blotting法檢測(cè)肺組織勻漿中自噬相關(guān)蛋白P62和LC3水平，并用免疫組化方法檢測(cè)P62和LC3在肺組織中的表達(dá)。染塵4個(gè)月時(shí)，處死另一半動(dòng)物，同樣進(jìn)行上述各項(xiàng)檢查。
　

5、　結(jié)果：
　　在矽肺形成過(guò)程中，跟陰性對(duì)照組相比，氯喹對(duì)照組體重沒(méi)有明顯改變，SiO2染塵三組大鼠的體重增長(zhǎng)有減緩趨勢(shì)，但只有氯喹預(yù)處理組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)解剖大鼠得肺臟可見(jiàn)，陰性對(duì)照組與氯喹對(duì)照組的肺臟均呈粉紅色，大小正常，質(zhì)地軟，無(wú)明顯異常發(fā)現(xiàn);但是三個(gè)SiO2染塵組大鼠的肺呈粉白色，且明顯增大，質(zhì)地韌，全肺表面彌漫性散在分布著白色斑點(diǎn)結(jié)節(jié)，質(zhì)地硬，但與SiO2模型組比較，氯喹處理組和氯喹預(yù)處理組

6、程度稍輕，肉眼看SiO2模型組大鼠的肺病交更嚴(yán)重。肺系數(shù)氯喹對(duì)照組與陰性對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異，三個(gè)染塵組與陰性對(duì)照組比較均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)，與SiO2模型組比較，氯喹處理組和氯喹預(yù)處理組的肺系數(shù)明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HE染色觀察，陰性對(duì)照組與氯喹對(duì)照組大鼠肺臟，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯異常發(fā)現(xiàn)。SiO2模型組肺泡壁增厚，肺間質(zhì)增寬并互相融合，巨噬細(xì)胞聚集且纖維組織增生形成，多個(gè)矽結(jié)節(jié)連接成片并發(fā)生明顯纖維化;氯喹處理

7、組和氯喹預(yù)處理組較SiO2模型組病交輕，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及多個(gè)獨(dú)立的矽結(jié)節(jié)，纖維組織增生。MASSON染色觀察，氯喹處理組與氯喹預(yù)處理組在2個(gè)月終點(diǎn)時(shí)膠原纖維的量較SiO2模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但是在4個(gè)終點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)膠原纖維的量與SiO2模型組無(wú)明顯差異。電鏡下觀察SiO2模型組與對(duì)照組比較發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中溶酶體活躍，存在較多自噬溶酶體并發(fā)生渾濁、膨脹，甚至發(fā)生空泡化。在2個(gè)月終點(diǎn)時(shí)免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)氯喹處理組與

8、氯喹預(yù)處理組的p62表達(dá)較SiO2模型組增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在4個(gè)月終點(diǎn)時(shí)觀察p62表達(dá)較SiO2模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LC3在2個(gè)月和4個(gè)月終點(diǎn)的表達(dá)均較SiO2模型組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Westernblotting結(jié)果，氯喹處理組與氯喹預(yù)處理組的P62和LC3表達(dá)均較SiO2模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　在本實(shí)驗(yàn)條件下，抑制自噬可以延緩矽肺發(fā)展的進(jìn)程，但最終不能改變矽肺的病理結(jié)