DEN2感染對HUVEC自噬的影響.pdf

1、目的：利用登革2型病毒NGC株（DEN2）感染人血管內(nèi)皮細胞（HUVEC），研究DEN2對HUVEC自噬的影響，為研究DEN2感染損傷血管內(nèi)皮細胞的機制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：50％組織細胞感染量（TCID50）測定DEN2 NGC株病毒對C6/36細胞的毒力；實時熒光定量PCR檢測DEN2感染HUVECDEN2 mRNA水平表達的變化；Western-blot檢測DEN2感染對HUVEC自噬標(biāo)記性蛋白LC3B表達的影響；激光共

2、聚焦顯微鏡觀察 DEN2感染 HUVEC自噬發(fā)生的現(xiàn)象，DEN2感染劑量為1×104TCID50。
　　結(jié)果
　　1.細胞貼壁呈梭形，生長良好，輪廓清晰，符合HUVEC生長特點；免疫組化法檢測 HUVECⅧ因子的表達，DAB染色后與空白對照對比可見細胞著色呈棕黃色。
　　2.DEN2對C6/36細胞的TCID50為10-5.6。
　　3.實時熒光定量檢測DEN2感染HUVEC后DEN2 mRNA。隨DEN2感染劑

3、量增加，病毒感染HUVEC組24h時DEN2 mRNA表達增加并呈上升趨勢，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；用巴伐洛霉素A1作用抑制后，1×102、1×103、1×104TCID50 DEN2感染組DEN2 mRNA表達增加并呈上升趨勢，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與未用巴伐洛霉素 A1抑制相比，相同 TCID50 DEN2感染 HUVEV的DEN2 mRNA的表達減少，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05)。
　　4.Western-bl

4、ot檢測 DEN2感染后24h對HUVEC LC3BⅡ/Ⅰ比值的變化。與空白對照組相比，1×102、1×103TCID50 DEN2感染組，LC3BⅡ/Ⅰ比值上升，LC3BⅡ、Ⅰ條帶灰度值增加；1×104TCID50 DEN2感染組LC3BⅡ/Ⅰ比值上升，LC3BⅡ、Ⅰ條帶灰度值增加,有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；用巴伐洛霉素A1作用抑制后，與空白對照組相比，1×102、1×103、1×104TCID50 DEN2感染組LC3BⅡ/Ⅰ比

5、值上升，LC3BⅡ、Ⅰ條帶灰度增加。與未用巴伐洛霉素A1抑制相比，1×102、1×103、1×104TCID50 DEN2感染組，LC3BⅡ/Ⅰ比值上升，LC3BⅡ、Ⅰ條帶灰度值增加。
　　5.激光共聚焦顯微鏡檢測24h HUVEC自噬現(xiàn)象，自噬標(biāo)記蛋白LC3B（綠色）、溶酶體標(biāo)記蛋白LAMP1（紅色）、DEN2 NS1（橘黃色）。在正常HUVEC，胞漿內(nèi)可觀察到綠色熒光、紅色熒光，熒光合成后，綠色、紅色熒光重疊；用巴伐洛霉素A1

6、作用抑制后，HUVEC胞漿內(nèi)可觀察到綠色、紅色熒光強度增加，熒光合成后，綠色、紅色熒光重疊部分減少；與正常HUVEC相比，1×104TCID50 DEN2感染組，在胞漿內(nèi)可觀察到綠色、紅色、橘黃色熒光，綠色、紅色熒光強度增加，在熒光合成后，綠色、紅色與橘黃色熒光重疊。
　　結(jié)論
　　1.在24h DEN2感染HUVEC后，隨著DEN2感染劑量增加，HUVEC DEN2載量增加；加巴伐洛霉素A1抑制后，DEN2增殖被抑制。