低氧誘發(fā)自噬對喉癌Hep-2細胞放化療敏感性的影響及Stat3對自噬調控作用.pdf

1、目的:觀察低氧微環(huán)境對喉癌Hep-2細胞增殖情況的影響及其對細胞自噬的作用，進一步研究細胞自噬對喉癌Hep-2細胞放化療敏感性的影響，探究Stat3信號通路對細胞自噬的調控作用及可能機制，尋求腫瘤預防和治療的新策略。
　　方法:
　　1體外常氧和低氧條件下培養(yǎng)喉癌Hep-2細胞，給予不同濃度順鉑(0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L,160μmol/L),不同劑量放射線(0

2、Gy,5Gy,10Gy,15Gy,20Gy)后繼續(xù)培養(yǎng)24h，MTT方法檢測細胞增殖情況。
　　2體外不同時間(3h，6h，9h，12h，24h)低氧培養(yǎng)喉癌Hep-2細胞，Western blot法檢測蛋白Stat3，p-Stat3，HIF-1α及自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達情況。給予Jak激酶抑制劑AG490(40mg/L)預處理1h繼續(xù)低氧培養(yǎng)6h，12h，24h后，Western blot法檢測蛋白Stat3，

3、p-Stat3及自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達情況。
　　3體外經AG49040mg/L預處理1h，3-MA(4mmol/L)預處理3h聯合不同濃度順鉑（0μmol/L，10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L），不同劑量放射線(0Gy，5 Gy,10 Gy,15Gy)繼續(xù)低氧培養(yǎng)24h，MTT方法檢測細胞增殖情況。雷帕霉素(100nmol/L)預處理3h聯合不同濃度順鉑化療（0μmol/L

4、，10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L），不同劑量放射線放療(0 Gy,5 Gy,10 Gy,15Gy)后繼續(xù)常氧培養(yǎng)24h，MTT方法檢測胞增殖情況。Western blot的方法檢測分別經3-MA和雷帕霉素處理后自噬標志性蛋白LC3的表達情況。
　　結果:
　　1不同濃度的順鉑、不同劑量的放射線干預喉癌Hep-2細胞后對細胞增殖具有抑制作用且具有濃度依賴性和劑量依賴性，不同濃度順鉑化療組

5、:低氧F=192.110，P=0.000＜0.01，常氧F=123.146，P=0.000＜0.01;不同劑量放射線放療組:低氧F=103.438，P=0.000＜0.05，常氧F=264.641，P=0.000＜0.01;差異具有統(tǒng)計學意義（方差分析的統(tǒng)計學方法）。常氧組與低氧組相比，不同濃度順鉑化療和不同劑量放射線放療，低氧組細胞的增殖抑制作用明顯下降，P＜0.01（獨立樣本T檢驗的統(tǒng)計學方法），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　2不

6、同處理方式后蛋白Stat3，p-Stat3，HIF-1α及自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達變化情況。
　　2.1不同低氧時間(0h，3h，6h，9h，12h，24h)培養(yǎng)Hep-2細胞Western blot法檢測蛋白Stat3，p-Stat3，HIF-1α及自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達情況，方差分析的統(tǒng)計學方法進行分析。與常氧條件下相比較Stat3蛋白在低氧條件下無明顯變化，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義;蛋

7、白p-Stat3及自噬相關蛋白Beclin1和LC3蛋白的變化于低氧6h后逐漸升高，24h達到較高水平，低氧培養(yǎng)6h，9h，12h，24h與常氧比較蛋白表達明顯升高，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義;HIF-1α蛋白的表達情況于低氧9h開始逐漸升高，24h達到高峰，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　2.2體外低氧培養(yǎng)Hep-2細胞，給予AG490預處理1h后繼續(xù)低氧培養(yǎng)6h,12h，24h，不同時間點AG490組與未加AG4

8、90組比較，Stat3蛋白表達無明顯變化，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義;蛋白p-Stat3，Beclin1和LC3表達明顯下降，6h，12h，24h，P＜0.01，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（獨立樣本T檢驗的統(tǒng)計學分析方法）。
　　2.33-MA(4mmol/L)、雷帕霉素（100nmol/L）預處理3h繼續(xù)分別低氧和常氧條件下培養(yǎng)24h，常氧組(24N)和常氧加雷帕霉素組（24N+RAPA）比較，24N+RAPA組LC3蛋白表達情

9、況明顯高于24N組，t=11.162，P=0.000＜0.01，差異具有統(tǒng)計學意義;低氧組(24H)與低氧加3-MA組(24H+3-MA)比較，24H+3-MA組LC3蛋白表達情況明顯低于24H組，t=13.074，P=0.000＜0.01，差異同樣具有顯著差統(tǒng)計學意義（獨立樣本T檢驗的統(tǒng)計學方法）。
　　3 MTT檢測不同濃度順鉑、不同劑量放射線與AG490，3-MA及雷帕霉素聯合應用后對細胞增殖的影響，獨立樣本T檢驗的統(tǒng)計學方

10、法進行數據分析。
　　3.1體外經AG49040mg/L預處理1h，3-MA(4mmol/L)預處理3h后聯合不同濃度順鉑化療、不同劑量放射線放療繼續(xù)低氧條件下培養(yǎng)24h后，MTT檢測細胞增殖情況，AG490，3-MA組與僅放化療組相比，細胞增殖抑制明顯增加，當順鉑濃度為10μmol/L，3-MA組與單純化療組相比P＜0.05，其他AG490，3-MA組與僅放化療組相比P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.2體外雷帕霉

11、素(100nmol/L)預處理3h后聯合不同濃度順鉑化療，不同放射劑量放療后繼續(xù)常氧培養(yǎng)24h后，雷帕霉素組細胞增殖抑制較僅放化組明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(聯合應用雷帕霉素組與單純放射線放療相比，僅10Gy,15Gy時P＜0.05，其他各組P＜0.01)。
　　結論:
　　1不同濃度順鉑化療和不同劑量放射線放療在低氧和常氧條件下均對Hep-2細胞增殖具有抑制作用，且低氧可以增加腫瘤細胞對放化療的抵抗。
　　2低氧可以

12、促進Hep-2細胞Stat3的磷酸化，誘導HIF-1α的表達，而對總Stat3沒有影響;低氧可以促進自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達，誘發(fā)細胞自噬。抑制Stat3的磷酸化可以抑制自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達，從而抑制自噬過程，增加腫瘤細胞低氧放化療敏感性。
　　33-MA可以抑制喉癌Hep-2細胞低氧誘發(fā)的自噬，減少自噬相關蛋白LC3的表達，增強腫瘤細胞低氧放化療敏感性;雷帕霉素可以誘發(fā)Hep-2細胞自噬，增加