游離脂肪酸對(duì)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞的脂毒性及非諾貝特的保護(hù)作用.pdf

1、生理水平的游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）在機(jī)體內(nèi)起著重要的生理作用，不但為組織器官提供能量，而且是胰島β細(xì)胞釋放胰島素所必需。然而，血游離脂肪酸水平長(zhǎng)期升高時(shí)，肝臟、骨骼肌、脂肪組織等不能將FFA氧化和轉(zhuǎn)化為甘油三酯，使FFA沉積于非脂肪組織而對(duì)組織和細(xì)胞的功能和代謝造成損害，又稱(chēng)為游離脂肪酸的脂毒性。研究表明，胰島素抵抗患者、肥胖癥和2型糖尿病患者往往存在空腹和餐后高游離脂肪酸血癥。近年來(lái)，血漿游離脂肪酸升高

2、對(duì)細(xì)胞的脂毒性，成為糖尿病病理生理機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，代謝綜合征患者血管組織長(zhǎng)期暴露于高FFA環(huán)境中，血管形態(tài)和功能可受到明顯損害。綜上所述，采用適當(dāng)?shù)拇胧└深A(yù)胰島素抵抗患者FFA誘導(dǎo)的損傷是非常必要的。 本研究采用含有軟脂酸的培養(yǎng)液與胰島內(nèi)皮細(xì)胞株MS-1共孵育，模擬血漿游離脂肪酸的作用，評(píng)估游離脂肪酸對(duì)胰島內(nèi)皮細(xì)胞增殖率和凋亡的影響，探討胰島素抵抗及糖尿病患者胰島微血管損害的可能機(jī)制。 氯貝丁酸類(lèi)藥包括非諾

3、貝特、吉非貝特、氯貝丁酯，是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α（（peroxisome proliferators-activated receptor-α，PPARα）的人工合成配體，作為調(diào)脂藥物已經(jīng)在臨床上使用了三十余年。研究已經(jīng)證實(shí)氯貝丁酸類(lèi)藥物可以調(diào)節(jié)眾多基因的轉(zhuǎn)錄，包括線(xiàn)粒體脂質(zhì)過(guò)氧化物酶體和微粒體中與脂肪酸氧化有關(guān)的基因，對(duì)于脂肪酸的生物氧化、脂肪貯存均具有關(guān)鍵的作用。近年的研究表明氯貝丁酸類(lèi)藥物還具有有益的非調(diào)脂作用，例如抗氧

4、化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤細(xì)胞增殖、抗微血管病變、保護(hù)微血管內(nèi)皮等作用。 2005年和2007年報(bào)導(dǎo)的大型FIELD（Fenofibrate Intervention and Event Lowering in Diabetes）臨床研究證實(shí)，2型糖尿病患者長(zhǎng)期使用非諾貝特治療可顯著減少糖尿病患者微血管事件，可以顯著延緩糖尿病患者已有視網(wǎng)膜微血管病變的進(jìn)一步發(fā)展，證實(shí)非諾貝特對(duì)微血管的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)非諾貝特可通過(guò)多種機(jī)制對(duì)腎小

5、球內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用。 本研究采用非諾貝特進(jìn)行干預(yù)，初步探討游離脂肪酸損傷IMEC的機(jī)制以及非諾貝特的保護(hù)作用，為臨床干預(yù)游離脂肪酸介導(dǎo)的胰島微血管損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一章、游離脂肪酸誘導(dǎo)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究。 研究目的： 觀(guān)察軟脂酸對(duì)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞株MS-1增殖率、凋亡率的影響。 研究方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)：MS-1細(xì)胞使用含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5％

6、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3d換一次液，4-5d傳代一次。 2.軟脂酸DMEM培養(yǎng)液制備：軟脂酸溶于無(wú)水酒精，置于通風(fēng)櫥中過(guò)夜干燥。加入相當(dāng)分子量的NaOH溶液，加熱溶解，制成皂化液。使用前加熱溶解，加入含1％BSA的DMEM完全培養(yǎng)基中，磁力攪拌器攪拌4h，制備成含有1.0mmol/L軟脂酸的DMEM工作液。 3.試驗(yàn)分組：研究設(shè)置對(duì)照組和軟脂酸試驗(yàn)組，分別用含1％BSA的DMEM培養(yǎng)基和含有0.5mmol/L、1.0m

7、mol/L軟脂酸和1％BSA的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。 4.MTT細(xì)胞增殖率試驗(yàn)：處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MS-1細(xì)胞制備成最終濃度為1×105/mL的細(xì)胞-DMEM懸液接種于96孔板。與含有不同軟脂酸的DMEM工作液，培養(yǎng)12小時(shí)，加入20μLMTT（5mg/mL），避光37℃，5％CO2孵育4小時(shí)，加入DMSO，震蕩混勻后于酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm的OD值。計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率=樣本OD/對(duì)照組OD均數(shù)×100％。 5.熒光

8、顯微鏡檢測(cè)凋亡細(xì)胞將軟脂酸孵育后的細(xì)胞行AnnexinV-FITC/PI雙染色，熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞凋亡情況。 6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞用胰酶消化后，經(jīng)AnnexinVFITCF/PI雙染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞。 7.數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)以x±SD表示，采用SPSS13.0分析，所有各組所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)符合正態(tài)分布后行相應(yīng)分析，單因素設(shè)計(jì)資料數(shù)據(jù)采用one-wayANOVA分析組間差異顯著性

9、，析因設(shè)計(jì)資料的組間差異顯著性檢驗(yàn)使用析因方差分析，組間兩兩比較使用LSD法（滿(mǎn)足方差齊性時(shí)）或：Dunnett'sT3法（不滿(mǎn)足方差齊性時(shí)），P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.采用不同濃度的FFA（0、0.5、1.0mmol/L）處理生長(zhǎng)于正常培養(yǎng)液中的MS-1細(xì)胞，37℃、5％CO2溫育12h后MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞增殖率比較，培養(yǎng)液軟脂酸濃度升高，MS-1細(xì)胞增殖率隨之顯著降低，效應(yīng)呈濃度依賴(lài)性

10、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=67.986，P<0.001）。 2.熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞凋亡：將試驗(yàn)組標(biāo)本置于熒光顯微鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)細(xì)胞爬片上散落著被AnnexinV-FITC染色細(xì)胞表面顯示綠色熒光的凋亡細(xì)胞，以及細(xì)胞表面顯示綠色熒光、胞核被PI染色顯示紅色熒光的壞死細(xì)胞。 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞：流式細(xì)胞儀分析顯示，與對(duì)照組凋亡率[（6.27±2.12）％]比較，軟脂酸作用適當(dāng)時(shí)間可使MS-1細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異具

11、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），隨著FFA濃度升高、作用時(shí)間延長(zhǎng)，該細(xì)胞的凋亡率顯著升高（P<0.05）。 結(jié)論： 高游離脂肪酸水平長(zhǎng)期作用顯著降低胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力（細(xì)胞增殖率），隨著FFA濃度升高、作用時(shí)間延長(zhǎng)，該細(xì)胞的凋亡率顯著升高，提示高FFA水平可對(duì)該內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能造成損害。 第二章、非諾貝特對(duì)FFA誘導(dǎo)的胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞損害的干預(yù)作用。 研究目的： 1.研究過(guò)非諾貝特對(duì)于游

12、離脂肪酸（FFA）介導(dǎo)的胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞（IMEC）凋亡的干預(yù)作用。 2.檢測(cè)MS-1細(xì)胞一氧化氮（nitricoxide，NO）、超氧化物歧化酶（superoxideDismutase，SOD）和丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）含量，研究游離脂肪酸（FFA）介導(dǎo)的胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞（IMEC）氧化應(yīng)激損傷以及非諾貝特的干預(yù)作用。 研究方法： 1.試驗(yàn)分組：設(shè)置4個(gè)分組，分別為對(duì)照組、軟脂酸

13、組、低濃度非諾貝特干預(yù)組和高濃度非諾貝特干預(yù)組。空白對(duì)照用含1％BSA的DMEM培養(yǎng)基；軟脂酸組用含有1.0mmol/L軟脂酸和1％BSA的DMEM培養(yǎng)液；低濃度非諾貝特干預(yù)組和高濃度非諾貝特干預(yù)組提前先用含有10μM或40μM非諾貝特的DMEM培養(yǎng)液孵育24h，繼而用含有相應(yīng)濃度非諾貝特和1.0mmol/L軟脂酸、1％BSA的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后進(jìn)行各項(xiàng)分析。 2.MTT細(xì)胞增殖率試驗(yàn)：同第一章。

14、3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞：方法同第一章。 4.NO、SOD、MDA的測(cè)定：各組MS-1細(xì)胞采用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測(cè)上清NO含量；剩余細(xì)胞和培養(yǎng)液用反復(fù)凍融法粉碎細(xì)胞（重復(fù)3次），混勻后得到細(xì)胞混合液，用以檢測(cè)SOD和MDA濃度。 5.數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)以x±SD表示，采用SPSS13.0分析，所有各組所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)符合正態(tài)分布后行相應(yīng)分析，單因素設(shè)計(jì)資料數(shù)據(jù)采用one-wayANOVA分析組間差異

15、顯著性，組間兩兩比較使用LSD法（滿(mǎn)足方差齊性時(shí)）或Dunnett'sT3法（不滿(mǎn)足方差齊性時(shí)），P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.MTT試驗(yàn)分析：1.0mmol/L軟脂酸培養(yǎng)24小時(shí)使MS-1細(xì)胞增殖率顯著降低，降幅達(dá)83.8％（P<0.001），非諾貝特可顯著減輕該作用，使細(xì)胞增殖率顯著上升，并且非諾貝特濃度升高細(xì)胞增殖率隨之升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P<0.001）。 2.MS-1細(xì)胞凋亡

16、率檢測(cè)：1.0mmol/L，軟脂酸顯著升高M(jìn)S-1細(xì)胞凋亡率（P<0.001），與之比較，非諾貝特干預(yù)組細(xì)胞凋亡率升高顯著降低（P<0.001），隨著非諾貝特濃度升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P=0.001），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2所示。 3.軟脂酸組MS-1細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO含量顯著下降，與之比較非諾貝特干預(yù)組NO含量顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。隨非諾貝特濃度升高，NO含量也輕度升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

17、=0.001）。 4.軟脂酸組培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)的SOD總活力顯著降低，非諾貝特干預(yù)組與軟脂酸組比較SOD總活力上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。高濃度與低濃度非諾貝特組相比，SOD水平略有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。軟脂酸組MDA濃度顯著升高，非諾貝特干預(yù)組MDA水平有效降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。高、低濃度非諾貝特干預(yù)組的MDA濃度相近，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論：