eNOS基因轉(zhuǎn)染對大鼠小體積肝移植缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、本文從以下及方面進行了論述。
　　第一部分 eNOS重組腺病毒載體的制備
　　目的:構(gòu)建含有eNOS基因的重組腺病毒載體。
　　方法:(1)將重組腺病毒載體Ad-eNOS行基因測序。(2)將重組腺病毒載體
　　Ad-eNOS用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細胞包裝成病毒顆粒,應(yīng)用合成的eNOS基因引物行Real-time PCR鑒定。(3)通過測定吸光值計算病毒滴度并分裝。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)測序,Ad-eNOS基因

2、序列與GeneBank中的eNOS序列一致,比對符合率100％。(2)Real-time PCR鑒定重組腺病毒Ad-eNOS包裝成功。(3)經(jīng)病毒滴度測定,Ad-eNOS滴度為9.35×109PFU/ml。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了重組腺病毒載體Ad-eNOS質(zhì)粒,采用HEK293細胞進行腺病毒包裝,最終獲得重組腺病毒Ad-eNOS。
　　第二部分 eNOS基因轉(zhuǎn)染對L02肝細胞缺復(fù)氧損傷的保護作用
　　目的:探討eNOS

3、基因轉(zhuǎn)染對L02肝細胞缺復(fù)氧損傷的保護作用。
　　方法:采用L02肝細胞,放入低氧環(huán)境(含95％N2+5％CO2、PO2≤4Kpa)及復(fù)氧環(huán)境(85％O2+15％C O2,PO2≥13Kpa)孵箱中培養(yǎng),建立缺復(fù)氧模型,實驗分三組:實驗組加入Ad-eNOS處理;對照組和正常組加RPMI-1640培養(yǎng)液。實驗組和對照組放入缺復(fù)氧模型中培養(yǎng),正常組在5％CO2、飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。檢測培養(yǎng)液中ALT及NO的含量,Real-time

4、PCR檢測eNOS的基因表達,Western-blot檢測eNOS的蛋白表達,流式細胞檢測細胞凋亡。
　　結(jié)果:實驗組細胞培養(yǎng)液中ALT含量(26.26±3.78u/l)明顯低于對照組(48.42±5.31u/l)(P﹤0.05),但高于正常組(17.20±2.64u/l),差別有顯著意義(P﹤0.05);而NO的含量實驗組(18.89±3.30 umol/L)明顯高于對照組(6.44±2.11 umol/L)和正常組(8.85±

5、2.40umol/L)(P﹤0.05);Real-time PCR及Western-blot結(jié)果顯示實驗組eNOS在基因及蛋白水平的表達均明顯高于對照組及正常組(P﹤0.05);流式細胞結(jié)果顯示實驗組L02肝細胞凋亡明顯低于對照組(P﹤0.05),而正常組L02肝細胞凋亡很少。
　　結(jié)論:(1)腺病毒載體成功將eNOS基因轉(zhuǎn)染到L02肝細胞上,使其高表達eNOS基因及蛋白;(2)eNOS基因轉(zhuǎn)染可減輕L02肝細胞缺復(fù)氧損傷的細胞凋

6、亡;(3)eNOS基因轉(zhuǎn)染可能通過升高NO途徑對L02肝細胞缺復(fù)氧損傷有保護作用。
　　第三部分大鼠小體積肝臟移植模型的建立
　　目的:用改良二袖套法建立穩(wěn)定的大鼠小體積肝臟移植模型。
　　方法:在Kamada二袖套法的的基礎(chǔ)上,對大鼠原位肝移植術(shù)在取肝、灌注、修植肝等手術(shù)操作以及圍手術(shù)期的處理進行改良,建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植模;在此基礎(chǔ)上再建立穩(wěn)定的大鼠小體積肝臟移植模型。
　　結(jié)果:通過三階段比較,正式實驗

7、組在手術(shù)時間、無肝期、手術(shù)成功率、并發(fā)癥等方面均有明顯提高。
　　結(jié)論:(1)改良的二袖套法具有無肝期短、手術(shù)成功率高、大鼠術(shù)后存活時間長的優(yōu)點,是大鼠原位肝移植的理想術(shù)式;(2)在建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植模型的基礎(chǔ)上開展大鼠小體積肝移植模型有利于提高模型的穩(wěn)定性。
　　第四部分 eNOS基因轉(zhuǎn)染對大鼠小體積肝移植缺血再灌注損傷的保護作用
　　目的:探討eNOS基因轉(zhuǎn)染對大鼠小體積肝移植缺血再灌注損傷的保護作用。

8、>　　方法:SD大鼠12對,隨機分兩組(n=6)行小體積肝移植。對照組供體用空載體進行腹腔注射,實驗組供體用Ad-eNOS進行腹腔注射。36小時后取肝行小體積肝移植。門靜脈復(fù)流后6小時后處死模型,采血送檢肝功能;硝酸還原法檢測NO濃度;免疫組化檢測TNF-α、巨噬細胞;TUNEL法檢測肝組織的細胞凋亡;流式細胞檢測肝細胞凋亡率;Real-time PCR檢測肝臟組織的eNOS基因表達;Western-blot檢測肝組織中的eNOS蛋白表

9、達。
　　結(jié)果:(1)實驗組的ALT、AST、LDH顯著低于對照組;細胞凋亡率顯著低于對照組;(2)肝組織NO含量實驗組明顯高于對照組;(3)Real-time PCR及Western-blot結(jié)果顯示實驗組eNOS在基因及蛋白水平的表達均明顯高于對照組;(4)免疫組化發(fā)現(xiàn)TNF-α及巨噬細胞在對照組中高表達,實驗組中低表達。
　　結(jié)論:eNOS在大鼠小體積肝移植缺血再灌注損害中對肝細胞有保護作用,其作用機制可能與下調(diào)TNF