MiR-200a對人胰腺癌干細胞上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及體外生物學(xué)行為影響的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  研究miR-200a對從人胰腺癌細胞系PANC-1分選出的胰腺癌干細胞(Pancreatic cancer stem cells,PCSCs)EMT及體外生物學(xué)行為的影響。探索靶向調(diào)控胰腺癌干細胞中miR-200a的表達在預(yù)防及治療胰腺癌方面的可行性。
  方法:
  (1)細胞培養(yǎng)和流式細胞儀分選
  將人胰腺癌細胞系PANC-1細胞接種于由含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素(10U/ml

2、)和鏈霉素(100μg/ml)組成的培養(yǎng)基中,在5%CO2,飽和濕度,恒溫37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分散后的細胞進行計數(shù),移至5ml的試管中,用PBS洗滌兩次,以1×106/100μl重新懸浮于PBS中。分別加入抗人CD24-PE、抗人CD44-APC和抗人ESA-FITC抗體(稀釋度均為1:40),避光冰上孵育20min。根據(jù)廠商說明書將各自同型對照抗體配成相同濃度使用。PBS洗滌2次,樣本用500μl PBS重懸,進行流式細胞儀分選。細胞

3、常規(guī)分選兩次,并重新分析的純度,保證分選后的細胞純度>97%。數(shù)據(jù)用BD FACS Diva的軟件進行分析。
  (2)轉(zhuǎn)染miR-200模擬物
  將CD24+CD44+ESA+胰腺癌干細胞接種在6孔板中并孵育過夜。將含miR-200模擬物或者陰性對照序列的EntransterTM-R轉(zhuǎn)染液(配制成終濃度25nM)轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染6小時后更換培養(yǎng)液以避免細胞死亡。
  (3)實時定量RT-PCR
  根據(jù)說明書用

4、Trizol法提取總RNA,使用Power SYBR_ green PCR master mix試劑盒進行實時定量RT-PCR分析E-cadherin、N-cadherin、vimentin、ZEB1、Oct4和Nanog的mRNA表達。以GAPDH為內(nèi)參照。
  (4)microRNA表達分析
  使用miScript Reverse Transcription Kit逆轉(zhuǎn)錄細胞總RNA。使用miScript PCR Ki

5、t進行RT-qPCR分析轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組、陰性對照組胰腺癌干細胞miR-200a表達水平。以U6為內(nèi)參照。
  (5)Western blot檢測
  用RIPA裂解緩沖液裂解細胞并測定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE分離總蛋白并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜。配制含5%脫脂奶粉、0.1%Tween20的TBST緩沖溶液封閉膜,加一抗(兔抗人Oct4, l:2000;兔抗人Nanog,1:2000;兔抗人N-cadherin,1:1000;

6、鼠抗人Vimentin,1:500;兔抗人E-cadherin,1:1000;兔抗人ZEB1,1:1000)室溫孵育2小時。再加入HRP-偶聯(lián)的二抗(HRP-羊抗兔IgG抗體,1:5000;HRP-羊抗小鼠IgG抗體,1:5000)室溫孵育1小時,增強化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果。提取未轉(zhuǎn)染和已轉(zhuǎn)染miR-200a模擬物的細胞總蛋白進行Western blot,檢測E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、vimentin、Oc

7、t4和Nanog蛋白表達水平。以β-actin為內(nèi)參照。
  (6)Transwell小室遷移實驗
  1×105PCSCs被平鋪于非涂覆膜的上室,使其可以朝向下室中含血清的培養(yǎng)基遷移。孵育48小時后多聚甲醛固定細胞,以0.1%結(jié)晶紫(2mg/ml)染色。在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)通過膜孔遷移的細胞數(shù)量。每孔觀察3個隨機視野。
  (7)Transwell小室侵襲實驗
  1×105PCSCs置于Matrigel涂覆膜的

8、上室,檢測前每孔涂覆Matrigel60mg。細胞平鋪在不含血清或生長因子的培養(yǎng)基中,而添加血清的培養(yǎng)基被用作化學(xué)誘導(dǎo)劑置于下室中。將細胞孵育48小時后,用棉簽除去未通過膜孔侵入下室的細胞。收集膜下表面的細胞,用多聚甲醛固定和0.1%結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)侵入到膜下表面的細胞數(shù)量。每孔觀察3個隨機視野。
  (8)CCK法檢測細胞增殖能力和對吉西他濱敏感性
  調(diào)整各組細胞密度,按照每孔1000-3000個細胞/10

9、0μl培養(yǎng)基接種于96孔板中,各孔在不同時間點(24h、48h、72h、96h)或者在加入不同濃度(50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、2000ng/ml)吉西他濱后72h加入10μlCCK-8,37℃、5%CO2孵育3h。用酶標檢測儀(測定波450 nm)測定各孔吸光密度值。
  結(jié)果:
  (1)在PNC-1細胞中有(1.442±0.532)%細胞呈CD44+CD24+

10、,而僅有(0.492±0.334)%細胞呈CD44+CD24+ESA+。Oct4和Nanog基因在CD44+CD24+ESA+細胞中表達顯著上升。
  (2)定時RT-PCR顯示miR-200a、E-cadherin在PCSCs中表達顯著下調(diào),而N-cadherin、vimentin和ZEB1表達則顯著上調(diào)。
  (3)在PCSCs中過表達miR-200a導(dǎo)致在mRNA水平上上皮表型標志物E-cadherin表達上調(diào),而間質(zhì)

11、表型標志物N-cadherin、Vimentin和ZEB1和胚胎干性基因Oct4和Nanog表達下調(diào)。Western blot檢測結(jié)果顯示PCSCs過表達miR-200a后E-cadherin蛋白表達上調(diào),ZEB1、N-cadherin、Oct4和Nanog蛋白表達下調(diào),而Vimentin蛋白表達未見下調(diào)。
  (4)Transwell實驗顯示轉(zhuǎn)染組相比非轉(zhuǎn)染組或陰性對照組遷移和侵襲至膜下表面的細胞數(shù)目顯著減少,分別下降了0.33

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